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    —20℃）凍存——應(yīng)選較佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20℃）于冰箱備用。④關(guān)于Ab保存應(yīng)參照說明書。（3）Ab濃度的選擇Ab濃度不可太高或太低，因?yàn)锳g-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，若一方過剩則形成復(fù)合物小且少；極過剩時(shí)已形成的復(fù)合物亦會(huì)解體而呈現(xiàn)假陰性。——并非Ab濃度越高越好。3．Ab滴片技術(shù)——所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。[注意]滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。要領(lǐng)：甩凈組織周圍的水。4．PBS洗滌技術(shù)（1）洗滌的目的①保證離子濃度和PH值。②減少非特異反應(yīng)（平時(shí)Ab不可靠很純）（2）方法：洗三次，每次5分鐘。5．Ab孵育技術(shù)（1）必須在濕盒內(nèi)進(jìn)行，以防抗體的蒸發(fā)和干片。（2）溫度與時(shí)間4℃：過夜；37℃：2hor參考說明書6．光鏡控制顯色方法（1）室內(nèi)操作：注意溫度與時(shí)間的關(guān)系，室溫較宜5分鐘。（2）染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。對照組和染色結(jié)果的評(píng)價(jià)從以下幾個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)：1．陽性染色特點(diǎn)①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性～細(xì)胞與組織無區(qū)別）②染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一。如果要做免疫組化找融享生物。江蘇組織免疫組化檢測哪里有

酶消化法 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶，應(yīng)嚴(yán)格掌握好消化時(shí)間、溫度和濃度。胰蛋白酶使用濃度為0.05%～0.1%，消化溫度為37℃，消化時(shí)間為10～40**要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示:胃蛋白酶使用濃度為0.4%，消化溫度為37℃，消化時(shí)間為30～180要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示，如:Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原蛋白）等。熱修復(fù)法 現(xiàn)常用微波修復(fù)、高溫高壓修復(fù)、水浴加熱修復(fù)法。較常用的修復(fù)法是pH6.0枸櫞酸緩沖液。修復(fù)過程中的注意要點(diǎn)是:（1）達(dá)到規(guī)定的溫度（92℃～95℃以上）;（2）維持一定的時(shí)間，微波修復(fù)、水浴加熱須控制在10～15min，高溫高壓修復(fù)須控制在2min左右;（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原則可能完全丟失;（4）加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻20～30min，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型。江蘇IHC免疫組化染色融享生物為您提供一個(gè)專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，吊炸天的免疫組化。

標(biāo)本

實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。

其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本比較好常用、比較好基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中優(yōu)先的組織標(biāo)本制作方法?？贵w

免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

拍照

有條件的話比較好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序;應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查;防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡;檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色;激發(fā)光長時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象;所以較多不得超過2~3h;熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后;標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā);使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油;電源比較好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不只會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。

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    5．滴加抗體，4℃過液或室溫5′~1hour。6．，洗三次，每次5分鐘。7．滴加第二抗體，室溫15′~60′。8．洗凈，洗三次，每次5分鐘。9．滴加ABC復(fù)合物，室溫15~60分鐘。10．洗三次，每次5分鐘。11．Tris–HCL5~10分鐘，此步可省略。12．DAB—H2O2顯色：用，室溫5~30分鐘，隨時(shí)鏡檢（DAB用時(shí)新配）13．自來水洗凈。14．用Mayer蘇木素或甲基綠，復(fù)染胞核（可不染）。15．常規(guī)脫水、透明、封固、鏡檢。結(jié)果：棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物**抗原X的定位。免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項(xiàng)1．實(shí)驗(yàn)計(jì)劃①根據(jù)課題的內(nèi)容選用動(dòng)物，選用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動(dòng)物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若***法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物。②若要比較染色深淺在對照組與實(shí)驗(yàn)組間的差異，在貼片方面較好貼于同一張載片上，否則無可比性。③選用的試劑可靠，貨源充足，隨時(shí)可取。2．Ab稀釋度（如系購買的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無須稀釋（2）原液：①應(yīng)參照其提供的工作液濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)。如：工作液濃度為1∶1000，可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗(yàn)；若:1∶500有背景，1∶1000陽性反應(yīng)稍淺，可選1∶750進(jìn)行試驗(yàn)。②原液的保存。免疫組化服務(wù)找融享。山東免疫組化染色

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經(jīng)驗(yàn)總結(jié)編輯

做過病理實(shí)驗(yàn)的人都知道，實(shí)驗(yàn)看似容易，但真想把它做好，還是需要花上很長一段時(shí)間去積累和摸索經(jīng)驗(yàn)。我從事病理實(shí)驗(yàn)已有6年多了，在這段時(shí)間里，我做過許許多多病理相關(guān)實(shí)驗(yàn)，剛開始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，較好終結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期的效果。經(jīng)過一段時(shí)間的瀏覽和學(xué)習(xí)，從一些在論壇內(nèi)學(xué)習(xí)、請教，并結(jié)合實(shí)踐操作，我經(jīng)歷了初級(jí)——查找資料和摸索方法；中級(jí)——問題求助和不斷總結(jié)；高級(jí)——難題解答和經(jīng)驗(yàn)分享這三個(gè)階段，也學(xué)到了不少知識(shí)，積累了很多寶貴經(jīng)驗(yàn)，與大家一起分享下。

關(guān)于掉片

HE、Masson、番紅O、Nissl、Mallory等染色方法很少有掉片現(xiàn)象；免疫組化和細(xì)胞凋亡檢測我們采用專門購買的防脫片，由于整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程比較長，在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生掉片是很正常的現(xiàn)象。對于容易掉片的組織，如：骨組織、腦組織、皮膚組織等掉片有時(shí)候是不可避免的。

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