浙江外泌體iTRAQ

NTA技術(shù)已被作為外泌體表征手段之一，相較于其他表征方式NTA技術(shù)的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快。大致方法是：將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀，用激光光束穿過樣本，激光在腔室內(nèi)與顆粒相互作用時會發(fā)生散射，通過裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光，捕捉外泌體的布朗運動，實現(xiàn)顆?？梢暬?。然后使用Stokes-Einstein方程來測量粒子的平均速度，繼而估算粒子的大小。NTA能夠測量粒徑10-1000nm之間的顆粒，包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍，但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數(shù)據(jù)收集和分析參數(shù)，另外，NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運動的蛋白質(zhì)聚集體，因此無法排除其他物質(zhì)的干擾。外泌體是一種存在于細胞外的多囊泡體，通過細胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成。浙江外泌體iTRAQ

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認為是金標準，主要是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)、大小和形狀將其分離出來。首先4℃低速離心（300-500g，10min）去除死細胞以及細胞碎片，隨后以較高離心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小體，然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡，結(jié)尾以超速離心沉淀外泌體。通過懸浮以及重復(fù)超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多等優(yōu)點。但是此方法需要昂貴的超高速離心機，每次處理的樣本量較小，費時，電鏡鑒定時還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊，且上清中仍能檢測到大型囊泡，純度不高，另外高速離心會損傷外泌體影響下游實驗。細胞外泌體Dir從研究上來講并不太嚴格區(qū)分外泌體或微泡。

外泌體的臨床應(yīng)用：間充質(zhì)干細胞是目前較普遍使用的細胞類型，它具有自我更新，多向分化、分泌細胞因子和細胞外囊泡體、免疫調(diào)節(jié)、來源普遍等特點，在臨床診療中取得了良好的成果。間充質(zhì)干細胞來源外泌體與間充質(zhì)干細胞有著相似的功能，包括修復(fù)與再生組織、阻止炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)機體免疫，但外泌體相對于間充質(zhì)干細胞又有許多優(yōu)勢。首先，間充質(zhì)干細胞來源外泌體更穩(wěn)定，更好保存，易于管理和控制，可以人為改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量。其次，它們沒有活細胞，不會像間充質(zhì)干細胞那樣可能會過多增殖而放大療效或者病變導(dǎo)致疾病加重；另外，它有可能避免某些針對間充質(zhì)干細胞的調(diào)控問題，間充質(zhì)干細胞來源外泌體有代替間充質(zhì)干細胞的趨勢。干細胞外泌體攝取流式細胞技術(shù)是細胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法，其用于外泌體定量檢測的準確性也在不斷上升。

外泌體的提取、純化和鑒定：每一個外泌體研究者較初都要為外泌體的分離提取而煩惱。選擇的分離方式是利用超速離心的方式分離外泌體，并且可以選用梯度密度離心法得到純度更高的外泌體。另外利用外泌體自身的物理化學(xué)性質(zhì)所研發(fā)的各種市售的外泌體分離提取試劑盒也能達到分離效果。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）、粒子大小以及標志蛋白等方式實現(xiàn)的。近來的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在比較多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、瘤子的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能比較好的保護其包被的物質(zhì)，且能靶向特定細胞或組織，因此是一種比較好靶向給藥系統(tǒng)。外泌體可由間充質(zhì)干細胞、淋巴細胞和瘤子細胞等多種類型細胞主動分泌釋放。

近年來，外泌體的捕獲技術(shù)越來越多，微流體系也被用于外泌體提取，此方法能根據(jù)其物理和生化特性同時分離外泌體。采用這種方法獲得的樣品純度高，且可及時獲取外泌體用于疾病的相關(guān)檢測。在初次注射時外泌體粘附在微流控設(shè)備的內(nèi)表面，并在隨后的PBS注射中沖洗掉。此方法采用的設(shè)備復(fù)雜，所需的樣本量取決于流動通道的長度。另外，樣品量的注入速率比較低，因此，對于大樣品量，將需要較長的處理時間。外泌體在包括瘤子在內(nèi)的各種疾病的發(fā)病機理中具有重要的功能。目前，研究人員已開發(fā)了多種方法來分離外泌體，離心技術(shù)仍然是常用方法，其他方法，例如過濾、磁珠分離和色譜法等，也顯示出獨特的優(yōu)勢，但目前仍然沒有一種公認有效的提取方法，研究人員應(yīng)針對不同來源的樣本以及不同的下游分析選取較適宜的提取方案。外泌體的提取的方式：超速離心法。北京外泌體label free

外泌體普遍參與細胞間物質(zhì)運輸與信息傳遞，調(diào)控細胞生理活動。浙江外泌體iTRAQ

外泌體中常見的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體。現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。外泌體的提取的方式：超速離心法。浙江外泌體iTRAQ

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