外泌體的手法

外泌體（Exosomes）是細胞分泌到胞外的一種囊泡（ExtracellularVesicles，EVs），其大小為30-150nm，具有雙層膜結構和茶托狀形態(tài)，含有豐富的內含物（包括核酸、蛋白和脂質等），參與細胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液中，包括血液、唾液、尿液、乳汁等，同時也存在于組織樣本中，如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。腦組織分離方法簡述：將腦組織剪成薄片，放入離心管中加上消化液進行消化，經水浴、反復輕輕上下顛倒，再用移液間斷緩慢吹吸至消化結束。隨后加入培養(yǎng)基于消化液中，混勻，置于冰上。再進行一系列的差速超速離心過程，包括除雜、濾膜過濾、超離等。結尾用PBS重懸外泌體，用重懸后的外泌體進行下面的透射電鏡（TEM）、納米粒徑追蹤分子（NTA）和markerWB鑒定。外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml。外泌體的手法

外泌體與免疫反應、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞的神經系統相關疾病和病癥進展相關。由外泌體傳遞到受體細胞的蛋白質、代謝物和核酸有效地改變了它們的生物反應。這種外泌體介導的反應可以促進或阻止疾病。外泌體在調節(jié)復雜的細胞內通路方面的固有特性使其在許多疾病的診療控制方面具有潛在的用途，包括神經退行性疾病和病癥。外泌體可被設計用于遞送不同的診療有效載荷，包括短干擾rna、反義寡核苷酸、化療藥物和免疫調節(jié)劑，并具有將其遞送到預期目標的能力。血漿外泌體提取試劑盒生產廠家外泌體具有異質性，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別。

外泌體的提取分離方法：1、超濾離心：由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質，利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效，且不影響外泌體的生物活性，是提取細胞外泌體的一種新方法。2、磁珠免疫法：外泌體表面有其特異性標記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以普遍普及。

血漿中的外泌體蛋白既可以當作標志物，也可以進行機理研究？首先，研究人員將慢性淋巴瘤（CLL）患者分為2個亞組：疾病進展期和疾病慢性期。然后利用質譜技術分析了患者血漿外泌體蛋白組，發(fā)現S100-A9蛋白在進展期CLL患者中明顯高表達，可以作為CLL進展期診斷的輔助標志物。進一步，研究人員通過生信分析發(fā)現進展期CLL患者外泌體中的高表達蛋白質主要與炎癥和氧化應激有關，而NF-κB通路正是承接此效應的關鍵通路。通過從進展期CLL患者中分離富含S100-A9蛋白的外泌體加入CLL患者的PBMC細胞中，證實了S100-A9+外泌體能夠明顯促進進展期CLL患者PBMC細胞中IκBα蛋白的磷酸化上調，進一步活躍NF-κB通路。該研究證通過血漿外泌體蛋白組分析不只找到輔助診斷進展期CLL的標志物，并證實了S100-A9+外泌體可通過形成正向反饋調控，不斷活躍進展期CLL患者自身PBMC細胞中的NF-κB通路，促進CLL進展的特殊機理。外泌體的提取的方式：免疫磁珠法。

外泌體研究背景：胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體，主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml，可攜帶核酸、蛋白質質和脂質等，存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實，外泌體可以通過細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質等特定物質，發(fā)揮特殊的功能。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、腫細胞細胞發(fā)生了發(fā)展、神經細胞信號轉導過程中都發(fā)揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA。安徽外泌體NTA

外泌體提取在短時間（一周之內）使用，可以放在4度保存，如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。外泌體的手法

外泌體中常見的細胞質蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現在早期以及回收的核內體中，RAB7和RAB9主要出現在晚期的核內體。現有大量的研究發(fā)現外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯蛋白（包括膜聯蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族（CD63,CD81和CD9)）、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結腸上皮細胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）。外泌體的提取的方式：超速離心法。外泌體的手法

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