上清液提取試劑盒原理

AFC自動收集器是將qEV分離法這一過程自動化的儀器，將用來收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤內(nèi)，根據(jù)稱重精確測量流體體積，可精確的測量到樣品中每一個液滴的重量并精確測量總重量。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤的單獨中心孔中并送至廢液桶，避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中。在提取期間，當達到設定的提取體積后，轉(zhuǎn)盤會自動旋轉(zhuǎn)到下一個微量離心管繼續(xù)收集，到收集完成后自動停止。微滴式數(shù)字PCR技術不佳有效提高了核酸分子的擴增效率，而且由于采用微滴計數(shù)的方法進行定量，可以不依賴與RT-PCR的熒光信號和Ct值，對所測樣品中的核酸分子進行一定定量。從研究上來講并不太嚴格區(qū)分外泌體或微泡。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎，它可能活躍受體并隨后導致相關信號通路的活躍。上清液提取試劑盒原理

胞外囊泡和外泌體的異質(zhì)性。細胞外囊泡的兩大類是胞外體和外泌體。胞外體通過質(zhì)膜出芽釋放，大小在50~1mm之間。外泌體起源于內(nèi)泌體途徑，通過形成包含ILVs的ESEs、LSEs，較終形成多泡體。當MVBs與質(zhì)膜融合時，外泌體釋放(尺寸范圍~40~160nm)。外泌體是一個高度異質(zhì)性的群體，具有獨特的誘導復雜生物學反應的能力。外泌體的異質(zhì)性可以根據(jù)其大小、含量(載物)、對受體細胞的功能影響以及細胞來源來概念化。這些特征的不同組合導致了外泌體的復雜異質(zhì)性。外泌體生物標志物外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作為配體與細胞膜上的受體結合，從而活躍細胞內(nèi)的信號通路。

外泌體的提取分離的方法：1、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關），純度也受到質(zhì)疑；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質(zhì)量。2、密度梯度離心：在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。

細胞外小泡通過充當脂肪組織、肝臟、骨骼肌和免疫細胞之間的細胞間通訊方式，在肥胖及其代謝并發(fā)癥的發(fā)展中發(fā)揮作用。外泌體可能在外周胰島素敏感性的調(diào)節(jié)中起作用，外周胰島素敏感性是T2D發(fā)病機理的主要組成部分。外泌體似乎通過至少兩種不同的機制來調(diào)節(jié)胰島素敏感性，即通過調(diào)節(jié)炎癥或通過與胰島素反應性部位的直接相互作用。后者可通過與主要胰島素信號分子（例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt信號通路）相互作用而影響胰島素信號通路而直接或間接發(fā)生。與對照組相比，糖尿病患者的血漿EV含量更高，并且與對照組相比，糖尿病小鼠的血漿外泌體數(shù)量也更高。然而，確定外泌體的作用及其在肝/腸軸通訊中的潛在作用將需要對它們的組成有更好的了解，特別是飲食是否會改變腸源性外泌體的含量，因此就胰島素反應而言它們的生物學功能尚未研究。外泌體具有相似布朗運動的蛋白質(zhì)聚集體，因此無法排除其他物質(zhì)干擾。

外泌體提取在短時間（一周之內(nèi)）使用，可以放在4度保存，如果長時間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進行分裝，分別放在-20度或-80度。外泌體檢測方法：外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。鑒定方法從物理特征到表面分子標志物，多角度進行鑒定。l、透射電鏡鑒定法：簡稱TEM，適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察，即通常為茶托型或一側凹陷的半球形。2、納米顆粒追蹤分析法：簡稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡。外泌體生物標志物

超速離心法，這是目前外泌體提取較常用的方法。上清液提取試劑盒原理

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認為是金標準，主要是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)、大小和形狀將其分離出來。首先4℃低速離心（300-500g，10min）去除死細胞以及細胞碎片，隨后以較高離心速度(2000xg，10min)去除生物聚合物以及凋亡小體，然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡，結尾以超速離心沉淀外泌體。通過懸浮以及重復超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多等優(yōu)點。但是此方法需要昂貴的超高速離心機，每次處理的樣本量較小，費時，電鏡鑒定時還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊，且上清中仍能檢測到大型囊泡，純度不高，另外高速離心會損傷外泌體影響下游實驗。上清液提取試劑盒原理

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