PDX-1免疫熒光分析

來源: 發(fā)布時間:2023-12-01

細胞免疫熒光實驗注意事項:非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復(fù)過度。染色過深:一抗?jié)舛冗^高;染色試濃度過高或孵育時間過長;染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設(shè)陰性對照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時,保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。PDX-1免疫熒光分析

PDX-1免疫熒光分析,免疫

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合,用于檢測或定位各種抗原,也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,用于檢測或定位抗體,但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。ucp2免疫組化在1941年,Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進行免疫熒光實驗。

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免疫熒光實驗的注意事項:對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時間可以從10min到數(shù)小時,一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項:1)熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,或于4℃保存4h,時間過長,會使熒光減弱。2)每次試驗時,需設(shè)置以下三種對照:①陽性對照:陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照:陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照:PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中,始終保持濕潤,避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物,應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,避免因放置不平使液體流失,從而造成非特異性熒光染色。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,也可以用于檢測和定位抗體。

PDX-1免疫熒光分析,免疫

細胞的固定及免疫熒光:1)吸除培養(yǎng)基,一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,進行細胞固定,室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致)。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液,向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗(一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度),4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。N-cad免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。PDX-1免疫熒光分析

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,只要知道其中的一個因素,就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過一定時間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。PDX-1免疫熒光分析

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