COL-2免疫組化IHC

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-12-27

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍。注意:有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,因此夾取的時(shí)候要小心,注意 反正面,放在皿里洗比較方便,避免了來(lái)回夾取,另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS,稍晃一下就倒掉,沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,也可37度2小時(shí),感覺前者效果好,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),或者37度1半小時(shí),PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,指甲油封片子的四周,因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。COL-2免疫組化IHC

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直接免疫熒光:?jiǎn)慰贵w(一抗)用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合,并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):由于無(wú)需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,從而降低了物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題。與間接免疫熒光相比,時(shí)間縮短(操作步驟減少)。直接免疫熒光的缺點(diǎn):不允許通過(guò)二抗進(jìn)行信號(hào)放大;檢測(cè)靈敏度降低;熒光素結(jié)合一抗的選擇有限;與使用熒光二抗的檢測(cè)相比,更昂貴。間接免疫熒光:使用兩種抗體(一抗和二抗)進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白。首先,用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后,熒光素結(jié)合的二抗(與一抗具有不同的物種反應(yīng)性)識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合,熒光信號(hào)被放大,提供了更高的檢測(cè)靈敏度。osteocalcin(ocn)免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。

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免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

熒光物質(zhì),熒光色素:許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595~600nm,呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

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免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,熒光免疫法無(wú)放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,有相當(dāng)一部分即屬于此類,并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。osteocalcin(ocn)免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子,通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。COL-2免疫組化IHC

熒光效率:熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),得到的熒光強(qiáng)度也較大。COL-2免疫組化IHC