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細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;孵育過(guò)程中干片;抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深:一抗?jié)舛冗^(guò)高;染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng);染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白,進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào);建議設(shè)陰性對(duì)照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時(shí),保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位。HBSAg免疫熒光試驗(yàn)
熒光效率:熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)(熒光強(qiáng)度)/吸收光的光量子數(shù)(激發(fā)光強(qiáng)度)。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜(熒光光譜),即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng),且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),得到的熒光強(qiáng)度也較大。HBSAg免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期。
細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,現(xiàn)用現(xiàn)配。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘;5. PBS沖洗;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過(guò)夜(找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái),抗體就不容易溢出),還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,以分布均勻??贵w稀釋度1:60,較常用!8. PBS沖洗4次,各5分鐘;9加入熒光二抗,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,較常用!10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,或到顯微鏡下觀察。
免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。
免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。免疫熒光技術(shù)中,以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。MMP13免疫組化
熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。HBSAg免疫熒光試驗(yàn)
免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟:細(xì)胞爬片免疫熒光:在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;(圓蓋片:13mm24孔;18mm12孔;20mm6孔)用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(PBS配置),室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過(guò)夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。HBSAg免疫熒光試驗(yàn)