PDL-1/CD274免疫熒光染色

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確保抗原本身沒(méi)有信號(hào)。2、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性，可排除染色過(guò)程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。PDL-1/CD274免疫熒光染色

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過(guò)程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說(shuō)明書推薦濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜。CD45免疫熒光檢查熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測(cè)。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；2）抗體濃度不合適，參照抗體說(shuō)明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過(guò)高；抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；清洗不充分；樣本變干，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來(lái)追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。MYeloperoxidase免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù)。PDL-1/CD274免疫熒光染色

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。PDL-1/CD274免疫熒光染色