BGLAP/OCN免疫熒光試驗(yàn)

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程。BGLAP/OCN免疫熒光試驗(yàn)

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。CY3免疫檢測(cè)免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位。

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。

免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位。免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。CY3免疫檢測(cè)

免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。BGLAP/OCN免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。BGLAP/OCN免疫熒光試驗(yàn)