CD14免疫熒光分析

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；2）抗體濃度不合適，參照抗體說(shuō)明書(shū)的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過(guò)高；抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；清洗不充分；樣本變干，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。CD14免疫熒光分析

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類(lèi)很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱(chēng)為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱(chēng)為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱(chēng)為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。GFP免疫熒光試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測(cè)。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測(cè)定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類(lèi)別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測(cè)、免疫學(xué)、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時(shí)孵育：由于FIT容易萃滅，因此在孵育抗體時(shí)后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見(jiàn)的操作步驟。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱。2）每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn)，避免干燥。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子，通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。GFP免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)。CD14免疫熒光分析

基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢(xún)細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí)，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過(guò)使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù)，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài)；并分析免疫反應(yīng)。CD14免疫熒光分析