細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)就是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定，常用的方法有MTT、CCK8以及流式檢測(cè)。閱讀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，如果想證明一個(gè)***或者說(shuō)是一個(gè)作用條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，基本上大家都采用MTT或CCK8結(jié)合流式的雙標(biāo)準(zhǔn)來(lái)證明作用效果。所以，***先給大家介紹一下MTT和CCK8比色法的實(shí)驗(yàn)操作和注意事項(xiàng)。MTT實(shí)驗(yàn)操作1、在96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（細(xì)胞+無(wú)血清培養(yǎng)基）、實(shí)驗(yàn)組和空白組（無(wú)血清培養(yǎng)基），可以采用如下圖的排版方式：2、在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比.上海cck8檢測(cè)細(xì)胞增殖步驟
實(shí)驗(yàn)材料及試劑96孔板、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液***、酶標(biāo)儀等；細(xì)胞、CCK8等。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔按4×103個(gè)接種至96孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含10ｕL的毒性檢測(cè)液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為450nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為**終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長(zhǎng)***率＝[(對(duì)照組OD－實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD]×**，以分組為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)***率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)上海cck8同仁在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃,5% CO2）.
CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請(qǐng)見說(shuō)明書）：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃,5%CO2）。2、向每孔加入10μLCCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
CCK8檢測(cè)原理圖2操作步驟1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃,5%CO2）。2、細(xì)胞處理（不同實(shí)驗(yàn)處理方式不同）。3、向每孔加入10μLCCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。4、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。5、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。6、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。
cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再說(shuō)一下關(guān)于種板設(shè)置問(wèn)題。眾所周知周圍一圈孔因?yàn)檫吘壭?yīng)都是不用來(lái)做實(shí)驗(yàn)的。一般每組樣品我會(huì)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，得到的OD值去掉**大值與**小值，其余取平均值。我用的是排***，會(huì)省很多力氣，但是也會(huì)增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液***和選用**適***頭了。
能力有限，表達(dá)不清的大家湊合著看看吧。有疑問(wèn)的歡迎大家留言討論，我們的目標(biāo)是共同進(jìn)步，哈哈。 加入CCK8那會(huì)空白對(duì)照組的細(xì)胞剛好長(zhǎng)滿嗎？上海cck8和mtt哪個(gè)更好
CCK-8的英文全稱是Cell Counting Kit-8，也就是進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的一個(gè)盒子。上海cck8檢測(cè)細(xì)胞增殖步驟
培養(yǎng)基對(duì)CCK8測(cè)定的影響：不同的培養(yǎng)基中含有氧化還原性物質(zhì)不同，（主要是氨基酸的成分及糖含量），會(huì)與CCK8發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差，因此所用培養(yǎng)基要一致，不要更換其他培養(yǎng)基。比如DMEM空白吸收為0.93；1640培養(yǎng)基在0.5左右。另外培養(yǎng)基中有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影響測(cè)定，扣除空白吸收即可，可見空白孔非常重要，所以每次實(shí)驗(yàn)均要設(shè)定空白對(duì)照。另外，血清不影響測(cè)定。有師妹在做一個(gè)HIF1a***劑實(shí)驗(yàn)時(shí)，多加了這個(gè)***劑的濃度，上海cck8檢測(cè)細(xì)胞增殖步驟