CCK8原理、優(yōu)勢(shì)和步驟 檢測(cè)原理：
◆ Cell Counting Kit簡(jiǎn)稱CCK試劑盒，是一種基于WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。
◆ WST-8屬于MTT的升級(jí)產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 CCK8試驗(yàn)的總體實(shí)驗(yàn)心得.上海dojindo cck8使用方法
CCK-8的原理
所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。為什么是粗略的呢，因?yàn)檫@里沒(méi)有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低，有些細(xì)胞在***處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變，但是代謝率低了以后，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少，測(cè)出的Formazan也會(huì)減少，所以此時(shí)怎么算呢（此時(shí)我就比較懷戀中性紅了）？當(dāng)然也有解決的辦法，下期給大家介紹。因此可利用這個(gè)原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，在吸光度為450時(shí)檢測(cè)讀數(shù)。用途及常用的公 江蘇graphpad制作cck8曲線與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。
切記一定要使用無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一是可以排除血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；二是血清的存在會(huì)對(duì)吸光度的測(cè)量產(chǎn)生影響。以上是MTT比色法的介紹，MTT比色法因?yàn)樯婕暗轿雠囵B(yǎng)基溶解沉淀的操作，所以更適用于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞比較好選用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖，下面給大家介紹一下CCK8操作的注意事項(xiàng)。CCK8實(shí)驗(yàn)操作CCK8的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，可以直接加入細(xì)胞中長(zhǎng)時(shí)間孵育，而不用考慮試劑本身對(duì)細(xì)胞帶來(lái)的影響。向各孔中加入10ul的CCK-8檢測(cè)溶液。如若檢測(cè)的細(xì)胞增殖或毒性試驗(yàn)，需在此之前加入作用***培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，例如6h/12h/24h等，然后再加入CCK8檢測(cè)液。
7、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可?；盍τ?jì)算：保存條件：4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存兩年有效。在CCK-8試劑盒中，**主要的化學(xué)藥品是WST-8.
實(shí)驗(yàn)材料及試劑
96 孔板、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液***、酶標(biāo)儀等；細(xì)胞、CCK8等。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔按 4×103個(gè)接種至 96 孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測(cè)液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次， 取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為**終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。按公式計(jì)算生長(zhǎng)***率＝[(對(duì)照組 OD－實(shí)驗(yàn)組 OD)/對(duì)照組 OD] ×**，以分組為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)***率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)***率柱狀圖。 胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到比較好測(cè)定時(shí)間。湖北cck8結(jié)果分析
使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑.上海dojindo cck8使用方法
在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對(duì)于大多數(shù)情況孵育2小時(shí)左右就可以了。6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度（使用酶標(biāo)儀之前要提前開(kāi)啟10min預(yù)熱）測(cè)定完成后，保存數(shù)據(jù)。7.連續(xù)五天檢測(cè)，每天保持一樣的時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時(shí)間相同。注：若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。上海dojindo cck8使用方法
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