五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：·若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。·如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。·當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的**小接種量至少為1,000個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。CCK8試驗(yàn)的總體實(shí)驗(yàn)心得.上海cck8作圖
細(xì)胞活性檢測1.在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100ml/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5%CO2的條件下)。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。5.如果暫時(shí)不測定O.D值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。細(xì)胞增殖-毒性檢測1.在96孔板中配制100ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5%CO2的條件下)。上海cck8檢測計(jì)算CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測原理.
CCK8，即Cell Counting Kit-8，與MTT法的主要區(qū)別如下：一、原理不同1、Cell Counting Kit-8：CCK-8 試劑盒利用了日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開發(fā)的四唑鹽WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)。2、MTT法：其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。
用途：
***篩選、
細(xì)胞增殖測定、
細(xì)胞毒性測定、
**藥敏試驗(yàn)等。
所需設(shè)備及儀器：
10ul，100-200ul及多通道移液器
酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）
96孔培養(yǎng)板
二氧化碳培養(yǎng)箱
培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)比較好條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。
測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。 CCK-8用途：***篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、**藥敏試驗(yàn).
在做一些***毒性試驗(yàn)時(shí)，比如做鐵死亡途徑時(shí)，我們加入一個(gè)***叫C1，這個(gè)時(shí)候就需要提前換液，其實(shí)我們試過，還是會有一些影響。所以這時(shí)我們用中性紅檢測。我們實(shí)驗(yàn)室，通常會用20%的硫酸銅溶液放到細(xì)胞孵箱下層，預(yù)防******。理應(yīng)說，硫酸銅分子在水溶液中是硫酸根離子和銅離子，是不會揮發(fā)的。但是每次只要是新?lián)Q的硫酸銅溶液再做CCK-8，結(jié)果總是不好，我也不知道是什么原因。之前在我們實(shí)驗(yàn)室有發(fā)生過這樣的事情，這種有深有淺的才是該有的結(jié)果。我想說的是在有能力選擇范圍內(nèi)，盡量選擇好一點(diǎn)的試劑，免得浪費(fèi)時(shí)間。不同的種板數(shù)對檢測***的IC50影響大嗎？浙江celltiter glo 與cck8
無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對細(xì)胞毒性低.上海cck8作圖
在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時(shí)，對于大多數(shù)情況孵育2小時(shí)左右就可以了。6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度（使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱）測定完成后，保存數(shù)據(jù)。7.連續(xù)五天檢測，每天保持一樣的時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時(shí)間相同。注：若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。上海cck8作圖