蘇州RIP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

來(lái)源： 發(fā)布時(shí)間：2024-06-01

Co-IP的實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 細(xì)胞裂解：首先，細(xì)胞或組織被裂解，釋放其中的蛋白質(zhì)。
2. 抗體結(jié)合：然后，將特異性抗體（針對(duì)已知蛋白質(zhì)之一的抗體）加入到裂解物中。這些抗體會(huì)特異性地結(jié)合到目標(biāo)蛋白（誘餌蛋白）上。
3. 免疫復(fù)合物形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，形成免疫復(fù)合物。
4. 沉淀：接著，使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子（如瓊脂糖或磁性珠子）來(lái)捕獲免疫復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合，從而拉下抗體以及與之結(jié)合的目標(biāo)蛋白和任何相關(guān)的相互作用蛋白。
5. 洗滌：捕獲的免疫復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。
6. 洗脫和分析：免疫復(fù)合物被洗脫并進(jìn)行進(jìn)一步的分析，如Western blot（WB）或質(zhì)譜分析，以鑒定相互作用的蛋白質(zhì)。
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RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進(jìn)行交聯(lián)，以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細(xì)胞，獲得更小的染色質(zhì)片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片：通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進(jìn)行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
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免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過免疫沉淀（ChIP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗(yàn)證的抗體，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評(píng)價(jià)，以幫助做出決策。

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱IP）是一種生物化學(xué)方法，它利用特異性抗體對(duì)抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads（預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上），根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性，形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物，清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白，檢測(cè)是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測(cè)或其他檢測(cè)技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測(cè)方法檢測(cè)的蛋白質(zhì)。
免疫沉淀的操作步驟？

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免疫沉淀技術(shù)RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）是一種用于研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。RIP技術(shù)可以幫助我們了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過程，并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。
RIP技術(shù)的原理是利用針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體，將細(xì)胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來(lái)。然后，可以通過分離純化，對(duì)這些復(fù)合物中的RNA進(jìn)行檢測(cè)，如qPCR驗(yàn)證或測(cè)序分析。
表觀遺傳學(xué)和RNA生物學(xué)領(lǐng)域?qū)Σ煌琑NA作用和功能的關(guān)注增加。RNA-蛋白質(zhì)相互作用能夠調(diào)控mRNA和非編碼RNA的功能。對(duì)RNA潛能的這一新認(rèn)識(shí)帶動(dòng)了新方法的發(fā)展，使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)（抗原）之間的特異性相互作用。通過使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體，可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型，包括：
1. 個(gè)別免疫沉淀法（Individual IP）
2. 免疫共沉淀法（Co-IP）
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）
4. RNA免疫沉淀法（RIP）
近年來(lái)，免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡(jiǎn)便、快速和自動(dòng)化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹脂。
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀