上海Co IP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

來源： 發(fā)布時間：2024-06-12

ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）實驗是一種用于研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術。以下是ChIP實驗的實驗設計概述：
1. 目標蛋白的選擇：確定您想要研究的目標蛋白，例如特定的轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白修飾。
2. 樣本的準備：根據(jù)研究的需要選擇合適的細胞或組織樣本。
3. 抗體的選擇：選擇具有高特異性和親和力的抗體，這對于實驗的成功至關重要。
4. 交聯(lián)：使用甲醛等交聯(lián)劑將蛋白質(zhì)與DNA在體內(nèi)共價結合，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA復合物。
5. 細胞裂解：裂解細胞以釋放染色質(zhì)，同時保持蛋白質(zhì)-DNA復合物的完整性。
6. 染色質(zhì)的剪切：通過超聲或酶消化將染色質(zhì)剪切成適當大小的片段，通常在200-1000 bp之間。
7. 免疫沉淀：使用特定抗體與目標蛋白結合，然后利用蛋白A/G磁珠沉淀復合物。
8. 洗滌和洗脫：洗滌沉淀物以去除未特異性結合的蛋白質(zhì)和DNA，然后洗脫目標蛋白-DNA復合物。
9. 逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放DNA。
10. DNA的純化和分析：純化DNA并使用qPCR、芯片或測序技術（如ChIP-seq）進行分析。
免疫沉淀技術IP的實驗方法。上海Co IP免疫沉淀選磁珠還是瓊脂糖珠

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免疫沉淀技術的實驗設計通常包括以下幾個關鍵步驟：
1. 目標蛋白質(zhì)的選擇：
2. 抗體的選擇：選擇特異性強、親和力高的抗體來捕獲目標蛋白質(zhì)
3. 樣本的準備：收集和準備細胞或組織樣本。
4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放：選擇合適的裂解條件，如pH值、離子強度、去污劑等。
5. 蛋白質(zhì)濃度的測定：確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，以便于后續(xù)步驟的標準化。
6. 免疫沉淀的操作：將特異性抗體與裂解液混合，并在適宜的條件下孵育，以形成抗體-抗原復合物。
7. 非特異性結合的減少：通過預純化步驟去除可能的非特異性結合蛋白。
8. 洗滌：多次洗滌以去除未結合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。
9. 目標蛋白質(zhì)的洗脫：使用適當?shù)木彌_液洗脫抗體-抗原復合物。
10. 后續(xù)分析：對洗脫的蛋白質(zhì)進行進一步分析，如Western Blot.
11. 對照實驗：設計適當?shù)恼龑φ蘸拓搶φ?，以評估實驗的特異性和敏感性。
Protein AG免疫沉淀實驗視頻免疫沉淀選瓊脂糖珠還是磁珠？

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免疫沉淀實驗步驟：
1. 樣品制備
a. 懸浮細胞樣品處理：離心收集細胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×）?；靹蚝笾糜诒咸幚?0 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
b. 貼壁細胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞兩遍；用細胞刮棒刮脫細胞，收集至1.5mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑Cocktail，使蛋白酶抑制劑Cocktail的終濃度為1×）。吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸?；靹蚝笾糜诒咸幚?0 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長期保存）。
4. 后續(xù)：磁珠預處理——抗體吸附——抗原結合反應——抗體洗脫

免疫沉淀ChIP實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結構  (直徑 50-150 μm)  可以結合抗體  (繼而結合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設備。瓊脂糖珠呈多孔結構，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結合表面積滿足高容量的抗體結合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結合能力較強，而磁珠在得率，可重復性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀技術Co-IP實驗步驟。

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免疫共沉淀分析（Co-IP）與IP十分類似，基本的技術都是采用目標抗原特異性的固相化抗體；但IP的目標是純化單一抗原，而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結合的蛋白質(zhì)或配體。

在Co-IP實驗中，已知抗原稱為誘餌蛋白，與之結合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復雜的伴侶蛋白、信號分子、結構蛋白、輔助因子等，蛋白間相互作用強度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間。
基本的Co-IP實驗方案與IP相同，實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是，還有許多其他因素需要考慮，例如，結合和洗滌條件的優(yōu)化，優(yōu)化時，需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
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RIP技術的優(yōu)勢在于：
1. 特異性：利用特異性抗體，可以精確地捕獲目標RNA結合蛋白及其相互作用的RNA。
2. 應用場景多：適用于研究RNA結合蛋白、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
3. 技術結合：RIP后的RNA可以用于多種下游分析，如qPCR、測序等，為研究RNA的功能和調(diào)控提供了重要信息。
RIP技術的限制包括：
1. 抗體質(zhì)量：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能得到假陽性或假陰性結果。
2. 非特異性結合：可能存在非特異性結合問題，需要仔細的實驗設計和對照來控制。
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