Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理

來源： 發(fā)布時間：2024-07-05

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
3. 抗體預(yù)處理：如果使用預(yù)固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
4. 免疫沉淀反應(yīng)：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜，以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
5. 固相支持物的回收：對于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
6. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
7. 洗脫：使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
8. 后續(xù)分析：對洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀純化所得抗原量低是什么原因？Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理

Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理,免疫沉淀

“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白，進(jìn)行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實(shí)驗(yàn)。更確切地說，IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體，從復(fù)雜的混合物中，純化單一抗原的實(shí)驗(yàn)。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進(jìn)行，也可以一步完成。

常見的加樣順序：抗體和樣本(如細(xì)胞裂解物)一起孵育，然后加入親和微珠，用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白，如蛋白A、G或A/G等，直接或間接結(jié)合抗體)先進(jìn)行孵育，然后再加入含有抗原的樣本。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后，充分洗滌微珠，再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。
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Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計如下：
1. 樣品準(zhǔn)備：Co-IP實(shí)驗(yàn)通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證，一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證。內(nèi)源性相互作用通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測：得到沉淀后，需要驗(yàn)證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離，隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白。
4. 實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置：為了避免“假陽性”，需要設(shè)置正確的對照，包括陰性對照和陽性對照（Input組）。Input組為直接利用抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實(shí)性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和純化特定蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)方法。
優(yōu)點(diǎn):
1. 特異性強(qiáng)：利用特異性抗體捕獲目標(biāo)蛋白，可以有效地從復(fù)雜的生物樣本中分離出感興趣的蛋白質(zhì)。
2. 靈敏度高：可以檢測到低豐度的蛋白質(zhì)，包括瞬態(tài)或弱相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
3. 應(yīng)用范圍廣：適用于多種生物樣本，如細(xì)胞裂解物、組織提取物和生物流體。
4. 生物學(xué)洞察深入：能夠揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于理解細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞和調(diào)控機(jī)制。
5. 可與其他技術(shù)聯(lián)用：如與質(zhì)譜（IP-MS）聯(lián)用，可以準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)及其相互作用伙伴。
缺點(diǎn):
1. 對抗體依賴性高：需要高親和力和高特異性的抗體，抗體的質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. 可能存在非特異性結(jié)合：樣本中的其他蛋白質(zhì)可能與抗體或固相支持物發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景噪音。
3. 可能影響蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)：裂解和沉淀過程可能會改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能。
4. 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性：需要多次實(shí)驗(yàn)來確保結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。
5. 樣品處理：需要避免樣品降解和非特異性結(jié)合，這可能需要使用蛋白酶抑制劑和適當(dāng)?shù)木彌_液條件。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的應(yīng)用有哪些？

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ChIP技術(shù)的應(yīng)用：
1. 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的鑒定：研究特定轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合模式。
2. 組蛋白修飾的分布：分析不同組蛋白修飾在基因組上的分布情況，這些修飾與基因的活躍或沉默有關(guān)。
3. DNA甲基化研究：結(jié)合ChIP技術(shù)可以研究DNA甲基化對基因表達(dá)的影響。
4. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能：研究染色質(zhì)重塑對基因表達(dá)和細(xì)胞功能的影響。
5. 疾病相關(guān)基因的調(diào)控：研究疾病狀態(tài)下基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化。
ChIP技術(shù)是表觀遺傳學(xué)研究中的一個重要工具，它可以幫助科學(xué)家們理解基因表達(dá)是如何在分子水平上被精確調(diào)控的。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的應(yīng)用有哪些？深圳RIP免疫沉淀磁珠多少錢

免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計。Protein AG免疫沉淀實(shí)驗(yàn)原理

免疫沉淀純化所得抗原純度低一般有多種原因：
1. 非特異性蛋白污染
如果洗脫所得抗原純度較低，則有幾種方法可以進(jìn)行優(yōu)化。在結(jié)合或洗滌緩沖液中加入去污劑或其他可以降低非特異性結(jié)合的組分。使用普通微珠預(yù)純化樣本還可以降低非目標(biāo)分子的共純化。此外，還可以使用無關(guān)蛋白 (如BSA) 封閉微珠 。
2. 抗體污染
使用蛋白A、G或A/G的經(jīng)典免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中會出現(xiàn)抗體與抗原共洗脫的情況。如果共洗脫會影響下游分析，則需要使用抗體通過共價連接固定至微珠的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如Pierce 直接 IP 或交聯(lián) IP 的形式。
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀