南京ChIP免疫沉淀磁珠應(yīng)用

來源： 發(fā)布時(shí)間：2024-07-18

RIP實(shí)驗(yàn)步驟通常包括：
1. 細(xì)胞收集與交聯(lián)：培養(yǎng)細(xì)胞至適當(dāng)密度。使用交聯(lián)劑（如甲醛）進(jìn)行交聯(lián)，以固定蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
2. 細(xì)胞裂解：收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，釋放RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。在裂解過程中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
3. 超聲處理：使用超聲波破壞細(xì)胞，獲得更小的染色質(zhì)片段，這有助于后續(xù)步驟中抗體的接觸。
4. 除去細(xì)胞碎片：通過離心去除細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，收集含RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的上清液。
5. 免疫沉淀：將針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）的抗體加入到上清液中。孵育一段時(shí)間，使抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合。
6. 捕獲免疫復(fù)合物：添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的磁珠或瓊脂糖珠。孵育使抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物與珠子結(jié)合。
7. 洗滌：多次洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
8. 洗脫與逆轉(zhuǎn)交聯(lián)：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫免疫復(fù)合物。使用蛋白酶K處理樣品以逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，釋放RNA。
9. RNA提取與純化：從免疫沉淀樣品中提取RNA，并進(jìn)行純化。
10. RNA分析：使用qPCR、Northern blot、RNA-Seq等方法分析沉淀的RNA，以確定與目標(biāo)蛋白相互作用的RNA種類。
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Co-IP的優(yōu)勢(shì)：
1. 生理相關(guān)性：Co-IP可以在接近生理?xiàng)l件的條件下捕獲蛋白質(zhì)相互作用。
2. 特異性：使用特異性抗體可以提高實(shí)驗(yàn)的特異性。
3. 廣泛應(yīng)用：Co-IP技術(shù)適用于多種樣本類型，包括細(xì)胞培養(yǎng)、組織樣本等。
Co-IP的局限性：
1. 抗體依賴性：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能得到假陽性或假陰性結(jié)果。
2. 非特異性結(jié)合：可能存在非特異性結(jié)合問題，需要仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)照來控制。
3. 技術(shù)挑戰(zhàn)：對(duì)于低豐度或弱相互作用的蛋白質(zhì)，Co-IP可能面臨技術(shù)挑戰(zhàn)。
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免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 蛋白質(zhì)濃度測定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
3. 抗體預(yù)處理：如果使用預(yù)固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
4. 免疫沉淀反應(yīng)：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過夜，以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
5. 固相支持物的回收：對(duì)于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
6. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
7. 洗脫：使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
8. 后續(xù)分析：對(duì)洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。

免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物組成以及特定蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
基本原理
免疫沉淀技術(shù)基于抗體與特定蛋白質(zhì)（抗原）之間的特異性相互作用。通過使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性抗體，可以從含有多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣本中捕獲并富集目標(biāo)蛋白質(zhì)。
免疫沉淀技術(shù)有多種類型，包括：
1. 個(gè)別免疫沉淀法（Individual IP）
2. 免疫共沉淀法（Co-IP）
3. 染色質(zhì)免疫沉淀法（ChIP）
4. RNA免疫沉淀法（RIP）
近年來，免疫沉淀技術(shù)在固相支持物的選擇上有了很大進(jìn)步。磁性微珠因其操作簡便、快速和自動(dòng)化程度高而逐漸取代了傳統(tǒng)的瓊脂糖樹脂。
免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)方法。

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免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通常包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：
1. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇：
2. 抗體的選擇：選擇特異性強(qiáng)、親和力高的抗體來捕獲目標(biāo)蛋白質(zhì)
3. 樣本的準(zhǔn)備：收集和準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
4. 蛋白質(zhì)的裂解和釋放：選擇合適的裂解條件，如pH值、離子強(qiáng)度、去污劑等。
5. 蛋白質(zhì)濃度的測定：確定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度，以便于后續(xù)步驟的標(biāo)準(zhǔn)化。
6. 免疫沉淀的操作：將特異性抗體與裂解液混合，并在適宜的條件下孵育，以形成抗體-抗原復(fù)合物。
7. 非特異性結(jié)合的減少：通過預(yù)純化步驟去除可能的非特異性結(jié)合蛋白。
8. 洗滌：多次洗滌以去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。
9. 目標(biāo)蛋白質(zhì)的洗脫：使用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫抗體-抗原復(fù)合物。
10. 后續(xù)分析：對(duì)洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析，如Western Blot.
11. 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)恼龑?duì)照和負(fù)對(duì)照，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)的特異性和敏感性。
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免疫沉淀和免疫共沉淀的區(qū)別？南京ChIP免疫沉淀磁珠應(yīng)用

免疫沉淀技術(shù)RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）的實(shí)驗(yàn)方法基于以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：
1. 細(xì)胞裂解：首先，細(xì)胞或組織樣本被裂解，以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物。
2.抗體特異性結(jié)合：裂解后的樣本中加入針對(duì)特定RNA結(jié)合蛋白的抗體。這些抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白。
3. 免疫復(fù)合物形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)捕獲：使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子（如瓊脂糖或磁性珠子）來捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合，從而拉下與之結(jié)合的復(fù)合物。
5. 洗滌：捕獲的復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析：從珠子上洗脫或消化復(fù)合物，分離出RNA，并進(jìn)行進(jìn)一步的分析，如qPCR、Northern blot或高通量測序（RNA-Seq）。
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標(biāo)簽： 支原體 免疫沉淀