溫州細胞支原體檢測方法等溫擴增

來源： 發(fā)布時間：2024-07-30

細胞培養(yǎng)中支原體難以徹底消滅的原因主要包括以下幾點：
1. 無細胞壁結構：支原體是沒有細胞壁的微生物，這使得許多作用于細胞壁的抗*素對支原體無效。
2. 微小體積：支原體體積小，能夠穿過常規(guī)的除菌濾膜，例如0.20微米甚至0.10微米的濾膜。
3. 隱匿性：支原體污染初期很難被察覺，它們在普通光學顯微鏡下幾乎不可見，因此細胞被支原體污染后，前期很難被發(fā)現(xiàn)。
4. 傳播途徑多樣：支原體可以通過細胞培養(yǎng)物、細胞懸液、細胞培養(yǎng)用具等途徑迅速傳播。
5. 污染源 ：支原體污染源包括細胞間的交叉污染、操作人員的口腔、皮膚，以及細胞培養(yǎng)用的組分如血清、培養(yǎng)液等。
6. 環(huán)境因素：實驗室環(huán)境、試驗臺、超凈臺、培養(yǎng)箱等可能被支原體污染，引起細胞的污染。
7. 抗*素耐藥性：支原體可能對某些抗*素產生耐藥性，使得治*效果變差。
8. 檢測和清理方法的局限性：一些傳統(tǒng)的支原體檢測和清理方法可能不夠靈敏或有效，導致難以徹底清理支原體
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一步法支原體檢測試劑盒的防污染版本通常采用等溫擴增技術，如LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）原理，通過支原體特異性引物在恒溫條件下對樣本進行檢測，終通過顏色變化確定樣品中是否含有支原體污染。這種方法的優(yōu)勢在于：
1. 快速檢測：可以在較短的時間內完成檢測，通常在60分鐘以內。
2. 高靈敏度和特異性：等溫擴增技術可以檢測到非常低濃度的支原體DNA。
3. 操作簡便：不需要復雜的設備，如PCR儀或電泳設備，只需水浴鍋即可完成擴增反應。
4. 減少污染風險：由于無需開蓋電泳，可以減少因氣溶膠造成的交叉污染。
此外，試劑盒還包含UNG（Uracil-N-Glycosylase）酶，用于防止PCR過程中的污染，UNG酶可以消化反應液中可能存在的尿嘧啶，從而減少因污染導致的假陽性結果。
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細胞培養(yǎng)過程中如果發(fā)現(xiàn)支原體污染，可以采取以下一些方法嘗試去除污染：

1. 抗*素治*：使用針對支原體有效的抗*素，如四環(huán)素類、大環(huán)內酯類、氟喹諾酮類等。根據(jù)搜索結果，可以加入高濃度抗*素進行沖擊治*，例如慶大霉素 200ug/ml，四環(huán)素10ug/ml，卡那霉素50ug/ml，并維持24-48小時后再換入常規(guī)培養(yǎng)液。
2. 加溫處理：支原體不耐熱，可以將細胞置于41°C中處理5-10小時以殺滅支原體。但需注意，高溫也可能對細胞造成傷害，因此需要預先確定對細胞影響較小的處理時間。
3. 使用支原體清除劑：市場上有專門的支原體清除劑，按照產品說明使用。
4. 使用支原體清*培養(yǎng)基：如Procell支原體清*培養(yǎng)基，這類產品含有清*支原體的特殊成分，可以抑制支原體生長并挽救珍貴細胞。
5. 物理方法：一些實驗室采用過濾的方法，使用0.22μm或更小孔徑的濾膜過濾培養(yǎng)基和試劑，以阻止支原體的侵入。
6. 細胞傳代：在一些情況下，通過細胞傳代可能有助于減少支原體的污染程度。

在科研中，支原體檢測是確保細胞培養(yǎng)純凈性的重要環(huán)節(jié)。以下是一些在科研中常見的支原體檢測方法：
1. 支原體培養(yǎng)法：這是一種傳統(tǒng)的檢測方法，通過將細胞培養(yǎng)物接種到特定的培養(yǎng)基中，觀察是否有支原體生長。這是直接的檢測方法，但耗時較長，通常需要數(shù)周時間。
2. DNA染色法：使用熒光染料（如Hoechst或DAPI）染色細胞核，然后通過熒光顯微鏡觀察。這種方法操作簡便，可以快速得到結果，但特異性不高，可能會有假陽性。
3. 聚合酶鏈反應（PCR）法：這是一種分子生物學技術，通過設計特異性的引物，擴增支原體DNA，從而檢測支原體的存在。PCR法具有高靈敏度和特異性，已成為日常細胞培養(yǎng)維護的可靠方法。
4. 核酸擴增技術（NAT）：NAT技術通過擴增并檢測特定的支原體基因組保守序列來進行支原體污染檢測，具有快速、簡便的特點。
支原體檢測有哪些方法？

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qPCR法，即定量聚合酶鏈式反應（Quantitative Polymerase Chain Reaction）法，是一種高度靈敏和特異的分子生物學技術，用于檢測和定量DNA序列。在支原體檢測中，qPCR法的原理主要包括以下幾個步驟：
1. DNA提取：首先從待測樣本中提取DNA，這可能包括細胞培養(yǎng)上清液或組織樣本中的支原體DNA。
2. 設計特異性引物：針對支原體的保守DNA序列，如16S rRNA基因，設計特異性的DNA引物。
3. 熒光標記探針：使用熒光標記的探針，該探針與目標DNA序列互補，能夠在PCR擴增過程中與擴增的DNA結合。
4. Ct值確定：Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）是指在PCR反應中，熒光信號強度超過預定閾值的循環(huán)次數(shù)。Ct值越低，表示樣本中支原體DNA的量越多。
5. 定量分析：通過標準曲線法或相對定量法，將Ct值轉換為支原體DNA的定量結果。
qPCR法的優(yōu)勢在于其高靈敏度和特異性，能夠檢測到非常低水平的支原體污染，并且可以在短時間內提供結果，這對于需要快速檢測的生物制品生產和細胞培養(yǎng)質量控制非常重要
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支原體檢測方法qPCR法？溫州細胞支原體檢測方法等溫擴增

支原體檢測中的PCR法和LAMP方法各有其優(yōu)勢和劣勢，以下是兩種方法的比較：

PCR法
優(yōu)勢:
1.高靈敏度：PCR法可以擴增支原體DNA，具有很高的靈敏度。
2.操作簡便：PCR操作相對簡單，結果準確，速度快，通常3個小時左右即可得到結果。
3.可靠性：PCR法已成為日常細胞培養(yǎng)維護的可靠方法，是細胞樣本庫保護細胞的方法。
劣勢:
1. 樣品量需求：相對于某些快速檢測方法，PCR可能需要較多的樣品量。
2. 檢測周期：盡管PCR法相對快速，但在某些情況下，檢測周期可能較長。
LAMP法
優(yōu)勢:
1. 設備簡單：只需要一個穩(wěn)定的恒溫環(huán)境，如恒溫水浴或熱擬溫器，不需要復雜的溫度控制設備。
2. 高特異性：LAMP技術采用多個特異性引物，提供了較高的特異性。
3. 結果可視化：LAMP擴增產物可形成肉眼觀察的顏色產物，有助于直接觀察擴增結果。
劣勢:
1. 引物設計復雜：需要設計多個引物，包括外部引物、內部引物和環(huán)引物，引物設計較為復雜。
2. 避免污染：由于沒有封閉系統(tǒng)，避免污染造成的假陽性是一個問題。
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