南通脫靶檢測(cè)方法

gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配： 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類(lèi)細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶？南通脫靶檢測(cè)方法

先導(dǎo)編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無(wú)需產(chǎn)生DSB，然而除了這4種堿基轉(zhuǎn)換，對(duì)另外8種堿基轉(zhuǎn)換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導(dǎo)編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實(shí)現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換，此外還能有效實(shí)現(xiàn)多堿基的精細(xì)插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白?？笴RISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制劑，由各種可移動(dòng)遺傳元件（MGEs）編碼，在不同階段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)45個(gè)Acr蛋白，其中 "AcrIIA4 "有可能保護(hù)細(xì)胞免受編輯。Shin和他的同事發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)整AcrIIA4或Cas9加入實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，AcrIIA4將脫靶修飾減少了4倍，而沒(méi)有減少靶向效應(yīng)。南通脫靶檢測(cè)安全性評(píng)價(jià)高深度全基因組重測(cè)序服務(wù),該方法能多方位精細(xì)地對(duì)基因編輯的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行off-target檢測(cè)。

CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞對(duì)于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細(xì)胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)盡可能采用多種方法評(píng)估其靶點(diǎn)相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于靶點(diǎn)相關(guān)毒性，應(yīng)采用體外方法深入分析靶點(diǎn)在人體qiguan、組織和細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，基因表達(dá)分析庫(kù)和文獻(xiàn)調(diào)研也可能會(huì)有助于闡明靶點(diǎn)在不同病理生理狀態(tài)下的表達(dá)是否存在差異。應(yīng)采用表達(dá)和不表達(dá)靶抗原的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，確認(rèn)CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞可特異性的識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞。對(duì)于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評(píng)估其胞外抗原識(shí)別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

GUIDE-Seq脫靶評(píng)估技術(shù)的優(yōu)勢(shì)分析鼓潤(rùn)致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測(cè)工作，為篩選、優(yōu)化基因組編輯工具的保真性提供標(biāo)準(zhǔn)化的分析。我們脫靶分析具有如下優(yōu)勢(shì)：實(shí)用性強(qiáng)：能反映CRISPR在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進(jìn)行安全性和有效性評(píng)價(jià)；檢測(cè)通量高：一次能檢測(cè)多個(gè)樣本的在靶與脫靶情況，并通過(guò)優(yōu)化的標(biāo)簽設(shè)計(jì)，降低實(shí)際的測(cè)序reads數(shù)量；準(zhǔn)確性高：絕大部分檢測(cè)結(jié)果可被驗(yàn)證；靈敏度高：能夠高效檢測(cè)出低頻脫靶位點(diǎn)，檢測(cè)低至0.1%的脫靶突變；實(shí)驗(yàn)難度低：操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)。脫靶檢測(cè)簡(jiǎn)單有效的方法之一是全基因組測(cè)序法。

由于設(shè)計(jì)的sgRNA會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列錯(cuò)配，引入非預(yù)期的基因突變，即脫靶效應(yīng)(Off-targeteffects)。脫靶效應(yīng)造成了研究中的許多不確定性，這無(wú)疑限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，研究者希望能開(kāi)發(fā)有效的方法來(lái)檢測(cè)脫靶效應(yīng)。在目前主流的脫靶效應(yīng)評(píng)估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標(biāo)記CRISPR/Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，然后對(duì)標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析從而確定脫靶位點(diǎn)。利用該技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)，從而改變了以往先預(yù)測(cè)假定脫靶位點(diǎn)再檢測(cè)的思路；與其他的評(píng)估方法相比，GUIDE-seq更精確、更靈敏。脫靶檢測(cè)服務(wù)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。武漢off-target脫靶檢測(cè)分析

通過(guò)對(duì)DSB的標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了全基因組無(wú)偏脫靶檢測(cè)，如IDLVs、BLESS、GUIDE-seq技術(shù)等。南通脫靶檢測(cè)方法

CIRCLE-Seq，將gDNA打斷并環(huán)化，環(huán)化的DNA與CRISPR/RNP孵育，NGS測(cè)序檢測(cè)線性化的DNapian段，確定脫靶位點(diǎn)。PCR富集后測(cè)序，成本相對(duì)較低，能檢測(cè)低頻脫靶突變。安必奇sgRNA脫靶效應(yīng)評(píng)估，安必奇生物提供sgRNA脫靶效應(yīng)評(píng)估服務(wù)，幫助您挑選高度特異，脫靶率低的sgRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，我們也協(xié)助您檢測(cè)分析基因編輯后細(xì)胞樣品的脫靶情況，通過(guò)各種高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)，我們能準(zhǔn)確的分析全基因組范圍內(nèi)的脫靶位點(diǎn)，推動(dòng)CRISPR/Cas9技術(shù)在zhiliao藥物開(kāi)發(fā)和臨床研究中的應(yīng)用。我們的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高：能檢測(cè)低頻脫靶突變★準(zhǔn)確性高：檢測(cè)結(jié)果可通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證★多種檢測(cè)方法可選擇以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求南通脫靶檢測(cè)方法