浙江高精度脫靶檢測評估標(biāo)準(zhǔn)

gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨?dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。挑選前面的潛在脫靶位點(diǎn)，通過PCR測序驗(yàn)證是否脫靶。浙江高精度脫靶檢測評估標(biāo)準(zhǔn)

先導(dǎo)編輯器：CBE和ABE組合使用可以有效地進(jìn)行4種堿基轉(zhuǎn)換（C→T, G→A, A→G, T→C），而無需產(chǎn)生DSB，然而除了這4種堿基轉(zhuǎn)換，對另外8種堿基轉(zhuǎn)換（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）以及堿基的插入和缺失，依然缺乏有效的研究工具。先導(dǎo)編輯器（Prime Editor, PE），PE在不依賴DSB和供體DNA的條件下便可有效實(shí)現(xiàn)所有12種堿基轉(zhuǎn)換，此外還能有效實(shí)現(xiàn)多堿基的精細(xì)插入（較多可插入44bp）和刪除（較多刪除80bp）。> 抗CRISPR蛋白?？笴RISPR（Acr）蛋白是天然的CRISPR/Cas系統(tǒng)抑制劑，由各種可移動遺傳元件（MGEs）編碼，在不同階段抑制CRISPR-Cas的免疫功能。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多達(dá)45個Acr蛋白，其中 "AcrIIA4 "有可能保護(hù)細(xì)胞免受編輯。Shin和他的同事發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整AcrIIA4或Cas9加入實(shí)驗(yàn)的時間，AcrIIA4將脫靶修飾減少了4倍，而沒有減少靶向效應(yīng)。江蘇育種脫靶檢測技術(shù)脫靶檢測分析，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品在生殖qiguan持續(xù)存在時，需要進(jìn)一步研究確定其在生殖細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞、精子）的暴露水平。根據(jù)載體類型、復(fù)制能力、基因組整合特性、劑量水平、給藥途徑等因素，分析評估基因zhiliao產(chǎn)品生殖系整合風(fēng)險。遺傳毒性，基因zhiliao產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險。目前對于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會產(chǎn)生遺傳毒性、是否較終會發(fā)生變依然還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知，因此，需要分析基因組改變（載體或遺傳物質(zhì)整合進(jìn)基因組、對基因組編輯等）的特征，并評估相關(guān)潛在風(fēng)險。

長期隨訪的觀察時間長期隨訪的持續(xù)時間應(yīng)確保足以觀察到受試者因產(chǎn)品特性、暴露情況（生物分布和給藥途徑）等導(dǎo)致的風(fēng)險，應(yīng)不短于遲發(fā)性不良反應(yīng)的預(yù)期發(fā)生時間。一般而言，針對不同類型的基因zhiliao產(chǎn)品建議如下：?具有基因組整合活性的載體（例如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體）和轉(zhuǎn)座子元件建議觀察不短于15年。?可以產(chǎn)生持續(xù)ganran、或有潛伏再jihuo風(fēng)險的細(xì)菌或病毒載體（如單純皰疹病毒）建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險（ganran或再jihuo）?；蚓庉嫯a(chǎn)品建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險。?腺相關(guān)病毒載體建議觀察5年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險。脫靶檢測評估，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

細(xì)胞外檢測方法：細(xì)胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測序流程獲得測序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息?？傮w來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫時定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點(diǎn)末端連接帶Biotin的接頭；再隨機(jī)打斷基因組，在另一端連接第二個接頭；經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序，實(shí)現(xiàn)了CRISPR切割位點(diǎn)的富集。該方法雖然提高了脫靶位點(diǎn)的檢測靈敏度，但有著較高的實(shí)驗(yàn)要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無法區(qū)分提純基因組DNA時發(fā)生的隨機(jī)斷裂和Cas9的切割，導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號。同時，由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點(diǎn)的一側(cè)，導(dǎo)致測序結(jié)果里只能看到脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。脫靶檢測CRO，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。深圳基因編輯技術(shù)脫靶檢測方法

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通常不需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性組合試驗(yàn)，但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點(diǎn)、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導(dǎo)入基因序列結(jié)構(gòu)等，評估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發(fā)生情況，并檢測隨后可能發(fā)生的異常細(xì)胞行為；評估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時，需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。浙江高精度脫靶檢測評估標(biāo)準(zhǔn)