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外泌體相關(guān)miRNA與肺病的診斷：miRNAs是一類含有20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，能夠通過下調(diào)或壓制靶mRNAs來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達(dá)，目前非編碼RNA被普遍發(fā)現(xiàn)存在于NSCLC患者外泌體中，參與一些病癥的形成和演化過程。單個(gè)miRNA可能通過壓制性復(fù)合物與多個(gè)mRNA結(jié)合，從而阻滯整個(gè)生物通路。因此，外泌體的miRNA具有成為NSCLC標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)。Chen等在152例肺病患者的研究中初次報(bào)道了循環(huán)游離miRNA的表達(dá)，與75例健康者相比，發(fā)現(xiàn)了兩種高表達(dá)的miRNA（miR-25和miR-223）。Rabinonowits等對(duì)27例肺病患者和9例健康人的血漿外泌體中12個(gè)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，12個(gè)一些病癥相關(guān)的miRNA*在肺病患者中過度表達(dá)。Cazzoli等收集了30個(gè)血漿樣本，發(fā)現(xiàn)4種外泌體miRNA（miR-378a、-379a、-139-5p、-200b-5p）在肺病患者血清中明顯升高，用于篩查患者與健康人ROC曲線下面積（AUC）為0.908。外泌體提純?cè)噭┖械奶厣c優(yōu)勢(shì)：樣本輸入量多樣。南京外泌體提取試劑銷售廠家

外泌體的提取方法學(xué)規(guī)范、統(tǒng)一定量及鑒定等。關(guān)于外泌體的提取有超速離心、試劑盒、超濾法、蔗糖密度梯度離心等，然而各種方法均有其利弊。超速離心法是目前外泌體相關(guān)文章中的主流方法，由于離心步驟繁瑣，費(fèi)事費(fèi)力，而且步驟多導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中容易污染，且損耗量大，使得較終回收的外泌體不穩(wěn)定。而且對(duì)于抽提細(xì)胞上清來說，更是極為不請(qǐng)便，試想用提取300ml的上清需要6個(gè)50ml離心管，無論是過濾還是后續(xù)的每一步的離心去沉淀，都具有操作極其不便的缺點(diǎn)，總之非常麻煩。而超濾法存在外泌體會(huì)堵塞膜孔，造成濃縮效率低，濃縮管重復(fù)利用差，甚至堵塞在膜孔的外泌體還可能會(huì)粘連成團(tuán)，造成損失及較后的數(shù)據(jù)有誤差，對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)也有影響。南昌正規(guī)外泌體提取試劑報(bào)價(jià)用于外泌體提取的體液收集注意事項(xiàng)：選擇血清還是血漿？推薦大多數(shù)研究選擇血漿。

外泌體，是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約40-100nm。盡管外泌體較初在1983年就被發(fā)現(xiàn)，但人們一直認(rèn)為它只是一種細(xì)胞的廢棄物。然而較近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。這些發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃了人們對(duì)細(xì)胞分泌膜泡的興趣。較近的研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、一些病癥的生長與遷移、組織損傷的修復(fù)等。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。

外泌體的提取、分離方法：開發(fā)高效、快速、穩(wěn)定，并且保持外泌體結(jié)構(gòu)和生物功能完整性的方法，是目前外泌體應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)和前提。從細(xì)胞上清和體液中提取分離外泌體的方法很多，但是外泌體的純度和產(chǎn)量卻和分離方法息息相關(guān)。通常分離步驟少、產(chǎn)率高，但是純度會(huì)受到影響。鑒于每種分離方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)樣本來源、下游實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?，選擇合適的外泌體分離方法。2015年，國際囊泡組織(InternationSocietyforExtracelluarVesicles,ISEV)指出，簡單依靠一種分離方法得到的外泌體的純度和產(chǎn)量都難滿足實(shí)驗(yàn)的需求。因此，推薦聯(lián)合使用各種方法，從而得到高純度和高產(chǎn)量的外泌體。外泌體的提取方法：密度梯度離心。

外泌體的形成與鑒定：首先，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成一個(gè)杯狀結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞表面蛋白和與細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)的可溶性蛋白，導(dǎo)致早期胞內(nèi)體(early-sortingendosome，ESE)的從頭形成，或者是杯狀結(jié)構(gòu)直接和已經(jīng)存在的ESEs融合；trans-高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也能協(xié)助形成ESEs。ESE成熟后形成晚期胞內(nèi)體(late-sortingendosomes，LSEs)，較終形成MVBs(也稱為多囊內(nèi)小體)。MVBs是通過endosome限制膜向內(nèi)凹(即質(zhì)膜雙凹)形成的，這一過程導(dǎo)致MVBs含有多個(gè)ILVs。MVB可以與溶酶體或自噬體融合，較終降解或與質(zhì)膜融合釋放作為外泌體的ILVs。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白、整合蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。使用可截留100KD分子量的膜，通過離心截留上清中的外泌體，截留完成后。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。太原正規(guī)外泌體提取試劑廠家

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外泌體的提取分離：1、PEG-base沉淀法。聚乙二醇（PEG）可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀，早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān)。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機(jī)械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會(huì)破壞外泌體等，因此發(fā)表文章時(shí)易受質(zhì)疑。2、試劑盒提取。近幾年來，市場(chǎng)上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設(shè)計(jì)的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進(jìn)行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。這些試劑盒不需要特殊設(shè)備，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。有些試劑盒操作簡便，不用超速離心，同時(shí)可獲得高純度和高回收率的外泌體。南京外泌體提取試劑銷售廠家

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