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來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-12

細(xì)胞傳代的方法都有哪些:根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代;部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。原代培養(yǎng)的開(kāi)始傳代應(yīng)注意的問(wèn)題?細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng),不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理,并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞;吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷;開(kāi)始傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些,使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。昆明原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家

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原代細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀:原代細(xì)胞自然生長(zhǎng)有兩種方式,錨定依賴或非錨定依賴,這主要取決于它們?cè)隗w內(nèi)的組織來(lái)源:外周血(非錨定依賴)或固體組織部位(錨定依賴)。原代細(xì)胞一旦分離后,24-48h內(nèi)需要進(jìn)行貼壁或起始,開(kāi)始培養(yǎng)。廣義地說(shuō),所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,無(wú)論其類型或來(lái)源,都需要在與人類生理?xiàng)l件非常相似的條件下生長(zhǎng)。此外,它們還需要一個(gè)pH可調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)環(huán)境,并且培養(yǎng)基中需包含細(xì)胞類型特定的營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、葡萄糖和/或物品。為了確定一種特定細(xì)胞類型在低至無(wú)血清培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)和功能所需的較低條件,相關(guān)研究工作已經(jīng)揭示了生長(zhǎng)培養(yǎng)基必須包含的基本成分:胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葡萄糖和各種鹽、維生素和氨基酸1。然而,除此之外培養(yǎng)基也可以含有組織和細(xì)胞特異性細(xì)胞因子和增殖、生存所需的生長(zhǎng)因子。例如,原代內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF),但是,應(yīng)該添加額外的組織特異性因子,以防止成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。石家莊正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價(jià)使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快,否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。

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原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng):1.收到細(xì)胞時(shí),要鏡下觀察是否有污染情況;收到細(xì)胞的前幾天,要做好各種倍數(shù)的鏡下拍照記錄,以防細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題后,可以跟公司很好地溝通。2.收到細(xì)胞后,不要馬上處理。應(yīng)置于培養(yǎng)箱中靜置4h以上再操作。如果不著急,可靜置過(guò)夜。3.細(xì)胞的靠前次傳代,一定要密度高一些傳代,原代細(xì)胞傳代密度低,很難長(zhǎng)起來(lái)。建議1:2-1:3傳代。4.原代細(xì)胞傳代時(shí)(內(nèi)皮細(xì)胞,貼壁為例),0.25%+0.53nM的胰酶消化,1ml消化液37度培養(yǎng)箱內(nèi)消化30sec,再加入5ml培養(yǎng)基(正常消化貼壁細(xì)胞,我們使用胰酶和培養(yǎng)基的量是1:1,但是原代細(xì)胞必須用大量培養(yǎng)基中和胰酶)。5.原代細(xì)胞不建議凍存,因?yàn)閮龃婧苋菀讖?fù)活不成功。如果要凍存的話,建議在P2或P3代凍存,凍存液中的血清越多越好,建議比例9(血清):1(DMSO)。6.原代細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),置于37-38度水浴融化細(xì)胞,并加入10ml培養(yǎng)液(正常貼壁細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),也可以使用這種比例,復(fù)蘇成活率會(huì)較大提高),離心重懸鋪板

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟(以24孔培養(yǎng)板為例):A.細(xì)胞接種:轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞,每孔500μl培養(yǎng)基(不可加物品),使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度在30-50%。B.siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備:1.6pmolsiRNA用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μlRFectPM用50μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻,室溫孵育5min。注意:確保在25min內(nèi)執(zhí)行第三步操作,不要過(guò)于延遲。3.孵育5min后,將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合(總體積100μl)。輕輕混勻,室溫孵育20min。C.將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)(完全培養(yǎng)基培養(yǎng)):1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi),培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板,混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h,檢測(cè)基因克制效果。如果需要,細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時(shí)可以更換培養(yǎng)基,但不是必須。孵育時(shí)間的長(zhǎng)短,取決于細(xì)胞類型、所干擾基因本身及分析方法??稍O(shè)置不同的孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定較佳孵育時(shí)間。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化:為了提高轉(zhuǎn)染效率,較好對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化,特別是開(kāi)始使用。原代細(xì)胞來(lái)源于或是新近死亡的供體,通過(guò)機(jī)械或酶方法解離獲得。

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原代細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀:原代細(xì)胞自然生長(zhǎng)有兩種方式,錨定依賴或非錨定依賴,這主要取決于它們?cè)隗w內(nèi)的組織來(lái)源:外周血(非錨定依賴)或固體組織部位(錨定依賴)。原代細(xì)胞一旦分離后,24-48h內(nèi)需要進(jìn)行貼壁或起始,開(kāi)始培養(yǎng)。廣義地說(shuō),所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,無(wú)論其類型或來(lái)源,都需要在與人類生理?xiàng)l件(即37°C,5%CO2)非常相似的條件下生長(zhǎng)。此外,它們還需要一個(gè)pH可調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)環(huán)境,并且培養(yǎng)基中需包含細(xì)胞類型特定的營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、葡萄糖和/或物品。為了確定一種特定細(xì)胞類型在低至無(wú)血清培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)和功能所需的較低條件,相關(guān)研究工作已經(jīng)揭示了生長(zhǎng)培養(yǎng)基必須包含的基本成分:胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葡萄糖和各種鹽、維生素和氨基酸1。然而,除此之外培養(yǎng)基也可以含有組織和細(xì)胞特異性細(xì)胞因子和增殖、生存所需的生長(zhǎng)因子。例如,原代內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF),但是,應(yīng)該添加額外的組織特異性因子,以防止成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞多來(lái)自部位組織,而懸浮細(xì)胞多來(lái)自血液系統(tǒng)的細(xì)胞。石家莊正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價(jià)

將凍存管立即從水浴中拿出,擦干,轉(zhuǎn)入無(wú)菌環(huán)境。昆明原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家

使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1.細(xì)胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%;如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,接種密度可以密一些,細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,靠前次使用建議您用24孔板做,每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件(siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例)放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可。昆明原代細(xì)胞分離試劑盒推薦廠家