原代細胞轉染實驗要點:轉染過程不可添加物品,否則會導致細胞死亡;開始實驗siRNA的用量設置在終濃度10nM、30nM、50nM、100nM進行摸索,后續(xù)實驗根據實驗結果修改。RFectPM可用來轉染siRNA、antisenseRNA、microRNA等200bp以內的小分子RNA和DNA,可轉染絕大多數(shù)原代細胞。對于大多數(shù)原代細胞,RFectPM的細胞轉染陽性率都在80%以上,而轉染細胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡便,先將sRNA與RFectPM室溫混合,再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細胞,血清對轉染效果沒有影響,不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時的細胞保持原有細胞的基本性質。珠海原代細胞分離試劑盒
原代細胞標準化培養(yǎng):由于每種原代細胞培養(yǎng)的條件迥異,而且每個實驗室都摸索出自己的培養(yǎng)條件,而對于一個特定的組織塊,所用培養(yǎng)條件不一樣,得出的所需細胞族群就不一樣,因為每種組織塊都含有不同種類的細胞群,而每一種細胞群在所選定的培養(yǎng)條件下(比如所選蛋白分解酶的種類和條件,細胞因子的種類,基礎培養(yǎng)基的種類或者是培養(yǎng)時間長短)都會得出不同的結果。由于各實驗室采取不同的培養(yǎng)條件,即使是同一塊心組織就有可能造成A實驗室獲得30%的心肌細胞,70%其他種類細胞,而B實驗室卻能獲得70%所需心肌細胞,30%為成纖維、脂肪等種類。這樣的話,即使是做同一項目的實驗,就有可能得出相反的科學結論。因此,早在2004年,美國科學界就質疑之前以原代細胞為主的科研文章,并同時提出原代細胞標準化培養(yǎng)的概念溫州正規(guī)原代細胞分離試劑盒報價將凍存管快速的放入37℃水浴中,輕輕握住并旋轉,直到管內物體完全融化。
原代細胞的幾大特點:1、生命的起源原代細胞人體起源一個單細胞受精卵(*代干細胞),經歷卵裂(干細胞持續(xù)擴增,增加細胞數(shù)量)、胚層出現(xiàn)(干細胞開始分化出功能細胞)、組織部位形成(功能細胞的有序排列)及胚后發(fā)育這樣一個連續(xù)過程。2、維持人體動態(tài)平衡的種子細胞人體通過干細胞化來實現(xiàn)細胞更新。成年并不意味著細胞增殖和細胞分化的結束,而仍然存在著受調控的組織更新過程。在一些組織中,如骨髓、表皮等,新細胞可不斷地產生,以補充因分化而衰老、死亡的細胞。干細胞的增殖保持著機體內細胞的動態(tài)平衡。
原代細胞培養(yǎng)實驗室常規(guī)步驟為:1)將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌、細菌、等污染源,這些污染源將會所需培養(yǎng)的原代細胞凋亡、停止生長和繁殖直至死亡,因此整個原代細胞培養(yǎng)過程中較全在無菌狀態(tài)下進行。2)將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘,通常在37C水浴里進行,而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型,比如成骨、肌肉、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞,但是對于腦組織和乳腺等軟組織,就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶,以免損傷分散出來的單個細胞。大多數(shù)組織可以制備原代細胞,但生長的快慢及難易程度不一。
原代細胞傳代培養(yǎng)方法:1.當細胞達到80-90%融合時需要傳代培養(yǎng)。2.提前準備好多聚賴氨酸(PLL,貨號0403)或纖維粘連蛋白(BPF,貨號8248)包被好的培養(yǎng)瓶。3.將完全培養(yǎng)基,胰酶/EDTA消化液(T/E,貨號0103),胰胰中和液(TNS,貨號0113)和不含鈣鎂離子的DPBS(貨號0303)加熱至室溫。我們不推薦用37度水浴加熱試劑和培養(yǎng)基。4.用DPBS沖洗細胞。5.以T-75培養(yǎng)瓶為例,向培養(yǎng)瓶中加入8mlDPBS,然后加入2ml胰酶/EDTA消化液。輕輕搖動培養(yǎng)瓶保證細胞被胰酶/EDTA消化液完全覆蓋。將培養(yǎng)瓶置于37度培養(yǎng)箱1-2分鐘直到細胞變圓。在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。6.在消化期間,準備一支50ml離心管加入5ml胎牛血清(FBS,貨號0500)用70%的酒精沖洗凍存管,然后擦去多余酒精。蕪湖正規(guī)原代細胞分離試劑盒
用多聚賴氨酸(或參照說明書)包被培養(yǎng)瓶。珠海原代細胞分離試劑盒
原代細胞與細胞系:永生化細胞系通常具有更快的倍增時間并可持續(xù)地分裂,為實驗提供一致的研究工具。然而,每次分裂都會引起遺傳漂移,降低了它們的生物學相關性。其優(yōu)點在于,當需要相同的遺傳背景時,可以從一個細胞系產生整個克隆群體以具有相同的基因型。但是,哺乳動物原代細胞是生命科學研究中不可或缺的一環(huán),因為它們在生理上類似于供體組織并保留其天然異質的基因組成。它們具有體內組織特異性特征并且純度高,因此,除了應用于大規(guī)模藥物篩選,越來越多地用于更可靠地研究生命科學,例如細胞代謝,信號傳導,和衰老等。珠海原代細胞分離試劑盒