徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

如何有效提高細胞轉(zhuǎn)染實驗效率：1.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑不同細胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細胞株列表和文獻，通過這些資料可選擇較適合實驗設計的轉(zhuǎn)染試劑。當然，較適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑。2.保持較佳的細胞狀態(tài)一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔儭］^適合轉(zhuǎn)染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞，細胞生長旺盛，較容易轉(zhuǎn)染。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉(zhuǎn)染特性也發(fā)生變化。因此，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結(jié)果。通過實驗優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細胞轉(zhuǎn)染效率影響因素：1.細胞密度一般來說，當細胞密度達到60%～80%時進行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率，過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果。2.細胞生長狀態(tài)這點非常關鍵，很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導致細胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性、降低細胞毒性，應盡量使用適度傳代的細胞系，并在不同次實驗時保持細胞傳代次數(shù)的一致性。3.細胞種類不同細胞種類的細胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細胞的轉(zhuǎn)染實驗。太原細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦轉(zhuǎn)染技術轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導入真核細胞的過程，是細胞和分子生物學研究的重要工具。

細胞轉(zhuǎn)染之PEI轉(zhuǎn)染法：1.細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于35mm培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，使細胞貼壁后所占面積達到培養(yǎng)皿總面積的70－90％）。將細胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h，當細胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h換液（用1.5ml無血清培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）。注：PEI轉(zhuǎn)染法對細胞生長有克制作用，在換液前細胞幾乎不生長，所以需要密度比較大時做轉(zhuǎn)染。2.制備PEI-DNA混合物以35mm組織培養(yǎng)皿用240μl反應總體積為例。先在無菌EP管中加入120μl1×HBS,再加入質(zhì)粒DNA（總量1-3μg為佳），混勻后加入等體積PEI工作液，充分混勻后室溫靜置20-30min，較后將這240μl的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育。

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：細胞狀態(tài)這點非常重要，不要急于求成，一定要讓細胞處于較佳的生長狀態(tài)再做。有文獻說傳代不要超過17代。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態(tài)較好，不要用傳了很多代的細胞去做，細胞的形態(tài)都會發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會導致和轉(zhuǎn)染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結(jié)果?；蛘?，幾種來源于經(jīng)篩選，轉(zhuǎn)染效率較高細胞亞系的細胞系現(xiàn)在有售。瞬時轉(zhuǎn)染后，可在48h-72h細胞長滿之后，提取細胞蛋白或者RNA。

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。太原細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家推薦

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細胞轉(zhuǎn)染操作方法：轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學介導方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉(zhuǎn)染技術。理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉(zhuǎn)染技術，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，細菌轉(zhuǎn)染方法的準備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。徐州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家