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如何有效提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)效率:1.選擇高效的轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法,但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法,但也要注意,因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同,質(zhì)粒定量差異,操作手法上的差異等,其轉(zhuǎn)染效果可能不同,應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來確定較佳轉(zhuǎn)染條件。2.確保所構(gòu)建載體的質(zhì)量。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建(細(xì)菌載體,質(zhì)粒DNA,RNA,PCR產(chǎn)物,寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。細(xì)菌載體對(duì)特定宿主細(xì)胞傳染效率較高,但不同細(xì)菌載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細(xì)胞周期,如逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,此外還需考慮一些安全問題(如基因污染)。除載體構(gòu)建外,載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用,轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,因此選擇組成或可調(diào)控,強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要,同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程,是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的重要工具。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家
轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng):細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明,對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染 血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率。
影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素:細(xì)胞狀態(tài)變化:(1)轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,也不是傳代很多次的細(xì)胞。這是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,較容易轉(zhuǎn)染。(2)把握時(shí)機(jī)沒錯(cuò)!轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī),相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過度生長(zhǎng)的狀態(tài),如細(xì)胞數(shù)量過多,互相疊加,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭,代謝廢物積聚,轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的!
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介:實(shí)驗(yàn)材料與器材:1、材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑(TransFast)2、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題,通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。是目前實(shí)驗(yàn)室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法:人工脂質(zhì)體法 原理:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實(shí)驗(yàn)步驟:在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑 → 脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合,形成復(fù)合物 → 脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合 → 復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿 → 分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況。轉(zhuǎn)染 ,是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑服務(wù)電話
直到外源基因在細(xì)胞分裂過程中因各種因素丟失為止。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家
如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑,以其適用宿主范圍廣,操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞毒性小,轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。脂質(zhì)體(liposome)是一種人工膜,在水相中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物,當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí),通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體(endosomes)進(jìn)入細(xì)胞,通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合,增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓,使內(nèi)體結(jié)構(gòu)破壞,釋放出核酸。隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)于普通細(xì)胞系,一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性,因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例,細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素,通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。杭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家