湛江qPCR儀消毒

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）通過在普通 PCR 反應(yīng)體系中加入了熒光標(biāo)記探針或熒光染料，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物變化。通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。具有專一性更高、可實時監(jiān)控、可重復(fù)精確定量等優(yōu)勢。qPCR的種類根據(jù)qPCR的化學(xué)發(fā)光原理一般分為2大類：一類是探針法，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；一類是基于SYBR Green I 的染料法，通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。qPCR實現(xiàn)了通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進行定量分析。湛江qPCR儀消毒

交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進行分析。交聯(lián)劑在整個過程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經(jīng)過交聯(lián)，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。華南地區(qū)高效qPCR儀使用說明qPCR面對小的差異較弱，dPCR則可識別差異較小的拷貝數(shù)。

染色質(zhì)片段化——DN段化:細胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對之間。剪切是難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動操作時間，但非常適合難以裂解的細胞；酶促消化不需要手動操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點不是隨機的。兩種方法都需要根據(jù)具體細胞系進行優(yōu)化。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲存。避免反復(fù)凍融。

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實驗成功的關(guān)鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細胞物質(zhì)。使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化:現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。Taqman探針法因特異性高，被廣泛應(yīng)用于等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重定量等。

常規(guī)PCR中，PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳，然后進行成像分析，常規(guī)PCR只能通過終點法對擴增產(chǎn)物進行定性分析，而不能進行定量分析；熒光定量PCR中，PCR反應(yīng)體系中加入了熒光分子，通過熒光信號的變化來反應(yīng)擴增產(chǎn)物的變化，使PCR產(chǎn)物的實時檢測成為可能。相對常規(guī)PCR而言，熒光定量PCR的主要優(yōu)點是準(zhǔn)確地確定初始模版拷貝數(shù)和較高的檢測靈敏度；熒光定量PCR不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù)；常規(guī)PCR的定量方法，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。而從圖中可以看出，雖然相同模版在同一臺PCR儀上進行96次擴增，終點處檢測產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴增曲線都有一個共同的拐點，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。q225 加樣孔板側(cè)壁和金屬熱塊能夠嚴(yán)密貼合，使液體樣品迅速達到設(shè)定溫度，從而減少實驗時間。湛江qPCR儀消毒

qpcr在擴增每個循環(huán)中模板DNA通過變性、復(fù)性、延伸三個階段形成更多的子代DNA，為下一個循環(huán)提供模板DNA。湛江qPCR儀消毒

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。湛江qPCR儀消毒

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