美國(guó)模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢(shì)。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí)。與PET比較，光學(xué)成像的應(yīng)用場(chǎng)合更廣（可測(cè)量更多的參數(shù)，請(qǐng)參見表1-1），且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)），空間分辨率可達(dá)到微米。因此，二者相比，雖然光學(xué)成像在測(cè)量深度方面不及PET，但在測(cè)量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢(shì)。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測(cè)量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像。多光子激光掃描顯微鏡更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問題, 擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。美國(guó)模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增加，即使繼續(xù)刺激，Ca2+熒光信號(hào)也不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到無刺激時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)粘附過程中Ca2+熒光信號(hào)沒有變化，但當(dāng)配子融合時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，持續(xù)數(shù)分鐘。這些現(xiàn)象對(duì)于研究受精發(fā)育的早期信號(hào)以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過程中，如細(xì)胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很大的變化。美國(guó)布魯克多光子顯微鏡成像精度多光子顯微鏡技術(shù)是對(duì)完整組織進(jìn)行深層熒光成像的優(yōu)先技術(shù)。

光學(xué)成像技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學(xué)問題提供了條件與可能。因此，在現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在動(dòng)物體內(nèi)，如何實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)及蛋白質(zhì)之間相五作用的實(shí)時(shí)在體成像監(jiān)測(cè)是當(dāng)前迫切需要解決的重大科學(xué)技術(shù)問題。這是也生物學(xué)、信息科學(xué)（光學(xué)）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科共同感興趣的重大問題。對(duì)這-一一科學(xué)問題的研究不僅有助于闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律、認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)展規(guī)律，而且對(duì)創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評(píng)價(jià)以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)等產(chǎn)生重大影響。

對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。利用多光子顯微鏡的多點(diǎn)光ji活能力，我們可以研究多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞之間的連接和控制。

對(duì)兩個(gè)遠(yuǎn)距離（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用兩條單獨(dú)的路徑進(jìn)行成像；對(duì)于相鄰區(qū)域，通常使用單個(gè)物鏡的多光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題，這個(gè)問題可以通過事后光源分離方法或時(shí)空復(fù)用方法來解決。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_；時(shí)空復(fù)用方法指的是同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束，每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上延遲，這樣就可以暫時(shí)分離被不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號(hào)。引入越多路光束就可以對(duì)越多的神經(jīng)元進(jìn)行成像，但是多路光束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間的重疊增加，從而限制了區(qū)分信號(hào)源的能力；并且多路復(fù)用對(duì)電子設(shè)備的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比，這會(huì)容易導(dǎo)致組織損傷。高精度、低損傷、高速掃描，多光子顯微鏡為科研工作提供強(qiáng)大支持。熒光多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn)，多光子顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究、免疫學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。美國(guó)模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化。美國(guó)模塊化多光子顯微鏡多光子激發(fā)