高速高分辨率多光子顯微鏡配置

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-11-22

對于兩個(gè)遠(yuǎn)距離(相距1-2mm以上)的成像部位,通常采用兩個(gè)**的路徑進(jìn)行成像;對于相鄰區(qū)域,通常使用單個(gè)物鏡的多個(gè)光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,這可以通過事后光源分離或時(shí)空復(fù)用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法;時(shí)空復(fù)用法是指同時(shí)使用多個(gè)激發(fā)光束,每個(gè)光束的脈沖在時(shí)間上被延遲,使不同光束激發(fā)的單個(gè)熒光信號可以暫時(shí)分離。引入的光束越多,可以成像的神經(jīng)元越多,但多束會(huì)導(dǎo)致熒光衰減時(shí)間重疊增加,從而限制了分辨信號源的能力;并且復(fù)用對電子設(shè)備的工作速度要求很高;大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比,這樣容易導(dǎo)致組織損傷。多光子激光掃描顯微鏡采用波長較長的紅外激光,能量脈沖式激發(fā),紅外光比可見光在生物組織中的穿透力更強(qiáng)。高速高分辨率多光子顯微鏡配置

高速高分辨率多光子顯微鏡配置,多光子顯微鏡

多光子激發(fā)在紫外成像的優(yōu)勢在可見光脈沖中能得到紫外衍射的顯微觀察像。即使不使用紫外域光源、光學(xué)元件用可見光源、光學(xué)元件就能得到紫外光激勵(lì)的高空間分辨率圖像。多光子在生物成像中的優(yōu)勢在生物顯微鏡觀察方面,較早考慮的是不損壞生物本身的活性狀態(tài),維持水分、離子濃度、氧和養(yǎng)分的流通。在光觀察場合,無論是熱還是光子能量方面都必須停留在細(xì)胞不受損傷的照射量、光能量內(nèi)。多光子顯微鏡則能夠滿足此,而且還具有很多優(yōu)點(diǎn)。如三維分辨率、深度侵入、在散射效率、背景光、信噪比、控制等方面,均有以往激光顯微鏡不具備,或具有無法比擬的超越特性。美國共聚焦多光子顯微鏡長時(shí)間觀察多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻(xiàn)、開發(fā)、進(jìn)步和數(shù)個(gè)世紀(jì)以來多個(gè)來源和地點(diǎn)的改進(jìn)。

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針對雙光子熒光顯微鏡的特點(diǎn),從理論上分析雙光子成像特點(diǎn),并搭建一套時(shí)間、空間分辨率高,能實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、多參數(shù)測量的雙光子熒光顯微鏡系統(tǒng)。具體系統(tǒng)應(yīng)實(shí)現(xiàn)∶(1)能對不同染料的雙光子熒光進(jìn)行探測;(2)用特定染料對樣品標(biāo)記以后,能實(shí)現(xiàn)雙光子熒光的三維成像;(3)通過實(shí)驗(yàn)的研究,改進(jìn)雙光子熒光顯微成像系統(tǒng);(4)在保證成像質(zhì)量的前提下,簡化整個(gè)系統(tǒng),使得實(shí)驗(yàn)操作方便、安全。單光子激發(fā)熒光的過程,就是熒光分子吸收一個(gè)光子,從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),躍遷以后,能量較大的激發(fā)態(tài)分子,通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動(dòng)能級像在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像研究中顯示了較大的優(yōu)勢。而在顯微成像中,雙光子熒光顯微鏡憑其獨(dú)有的優(yōu)點(diǎn),成為研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能檢測的重要工具。

在多光子顯微鏡(也稱為非線性或雙光子顯微鏡)中,以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品。更長的波長是有利的,因?yàn)樗鼈兛梢愿畹卮┩笜悠愤M(jìn)行3D成像,并且因?yàn)樗鼈儾粫?huì)損壞樣品,從而延長樣品壽命。為了實(shí)現(xiàn)多光子激發(fā),照明光束在空間上聚焦(使用光學(xué)器件),同時(shí)使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(gè)(或更多)光子同時(shí)到達(dá)同一位置(即熒光團(tuán)分子)的概率。多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生(SHG)、三次諧波產(chǎn)生(THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器,因此選擇能夠比較大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低GDD特性。多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類型的圖像對比提供有關(guān)樣本的有價(jià)值信息。

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2020年,TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度。近年來,通過使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描;但是,遠(yuǎn)程聚焦中反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度,ETL會(huì)引入球面像差和更高階像差,從而無法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些局限性,該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計(jì),能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描。該設(shè)計(jì)有兩種實(shí)現(xiàn)方式,第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描,另一種能夠進(jìn)行連續(xù)的軸向掃描。具體裝置如圖3a所示,由兩個(gè)垂直臂組成,每個(gè)臂中都有一個(gè)4F望遠(yuǎn)鏡和一個(gè)物鏡。遠(yuǎn)程聚焦臂包含一個(gè)檢流掃描鏡(GSM)和一個(gè)空氣物鏡(OBJ1),另一個(gè)臂(稱為照明臂)由一個(gè)水浸物鏡(OBJ2)構(gòu)成。將這兩個(gè)臂對齊,以使GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛。準(zhǔn)直的激光束被偏振分束器反射到遠(yuǎn)程聚焦臂中,GSM對其進(jìn)行掃描,進(jìn)而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)進(jìn)行橫向掃描。實(shí)現(xiàn)細(xì)胞層面觀察,多光子顯微鏡技術(shù)助力醫(yī)學(xué)突破。美國進(jìn)口多光子顯微鏡峰值功率密度

世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本,德國是徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司。高速高分辨率多光子顯微鏡配置

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深層成像等功能,這兩個(gè)優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識(shí)。2019年,JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個(gè)方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)[1]。想要將神經(jīng)元活動(dòng)與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像,這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會(huì)被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題,但這會(huì)帶來其他問題,例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。高速高分辨率多光子顯微鏡配置