國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理

在2020年12月22日，臨研所、病理科和科研處邀請北京大學王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學術報告。學術報告由臨研所醫(yī)學實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學信息科學技術學院副教授，畢業(yè)于北京大學物理系，獲學士、碩士學位，后于英國巴斯大學物理系獲博士學位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經元和神經突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學進展”和“中國科學進展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術在臨床診斷中的應用，為未來即時病理、離體組織檢測、術中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應用呢？國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。因其光損傷小、使得觀察熒光細胞成為可能。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。以小鼠顱內成像為優(yōu)勢，可觀察小鼠顱內神經細胞、小膠質細胞/巨噬細胞、周細胞、血管、轉移瘤細胞、膠質瘤細胞等的變化情況，在**學、神經生物學、發(fā)育生物學、神經退行性疾病等領域具有廣泛應用。小鼠其它組織臟器，如脾、顱骨、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射。

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術。激光掃描共聚焦顯微技術，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說，每個時刻，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式，一個個點的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長，只有當兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點，出才會激發(fā)出熒光。也就是說，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

目前，世界各國的腦科學研究如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動。其中，關于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點研究方向，而如何打破尺度壁壘，融合微觀神經元和神經突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是領域內亟待解決的一個關鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學分子醫(yī)學研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學技術學院電子學系、工學院以及中國人民******醫(yī)學科學院等組成的跨學科團隊，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團隊于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內上千個神經元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經元長達一個月的追蹤記錄。雙光子顯微鏡結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡的應用中，該如何選擇以及更好的使用PMT。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。國外2PPLUS雙光子顯微鏡原理