多光子激發(fā)的特點。激發(fā)波長∶兩個或多個光子同時激發(fā),激發(fā)波長是單光子激發(fā)波長的兩倍或多倍(i.e.紅光能激發(fā)UV探針)。多光子激發(fā)∶依賴于多個光子同時到達(dá)的時間。使用脈沖飛秒激光器(i.e.10-16 seconds),且能提供更高的峰值功率。熒光限制在焦點處,能滿足多個光子同時達(dá)到產(chǎn)生多光子吸收。熒光強(qiáng)度正比于(激光強(qiáng)度)n。為什么使用飛秒激光器?多光子激發(fā)需要超快的激光器,皮秒脈沖不能實現(xiàn)三光子激發(fā)。深度成像需要更高、更窄脈沖輸出功率。多光子激發(fā)光源處于近紅外區(qū),對細(xì)胞毒性和光漂白更小。顯微鏡產(chǎn)品正拉動市場需求,多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮?。美國進(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析
細(xì)胞在受到外界刺激時,隨著刺激時間的增長,即使刺激繼續(xù)存在,Ca2+熒光信號不但不會繼續(xù)增強(qiáng),反而會減弱,直至恢復(fù)到未加刺激物時的水平。對于細(xì)胞受精過程中 Ca2+熒光信號的變化情況,研究發(fā)現(xiàn),配了在粘著過程中,Ca2+熒光信號未發(fā)生任何變化,而配子之間發(fā)生融合作用時,Ca2+熒光信號強(qiáng)度卻會出現(xiàn)一個不穩(wěn)定的峰值,并可持續(xù)幾分鐘。這些現(xiàn)象,對研究受精發(fā)育的早期信號及 Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂、胞吐作用等,Ca2+熒光信號強(qiáng)度也會發(fā)生很的變化。美國共聚焦多光子顯微鏡代理商顯微鏡簡史:從光到多光子顯微鏡。
通過添加FACED模塊,可以將基于標(biāo)準(zhǔn)振鏡的現(xiàn)有2PM輕松轉(zhuǎn)換為千赫茲成像系統(tǒng)。FACED雙光子熒光顯微鏡遵循光柵掃描,需要很少的計算處理,在稀疏或密集的標(biāo)記樣本中均可以使用,并且不受串?dāng)_的影響,而且對整個圖像平面采樣后可以進(jìn)行運(yùn)動校正。實驗中沒有觀察到光損傷的跡象,此外,子脈沖延遲到達(dá)相同的樣品位置,能為熒光團(tuán)提供充足的時間使其從易于破壞的暗態(tài)返回到基態(tài),可以明顯減少光漂白。使用現(xiàn)有的傳感器,F(xiàn)ACED雙光子熒光顯微鏡可以提供足夠的速度和靈敏度來檢測神經(jīng)元過程中的鈣瞬變和谷氨酸瞬變,以及來自細(xì)胞體的尖峰和亞閾值電壓。該組使用基于FACED的2PM顯微鏡,在小鼠大腦中實現(xiàn)了千赫茲速率的神經(jīng)活動成像。在物鏡平均激光功率為10-85mW下,他們測量了清醒小鼠中V1神經(jīng)元的自發(fā)性和感覺誘發(fā)性的超閾值和亞閾值電位活動。
使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時,通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)來實現(xiàn),其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上,所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描,利用1對AOD,結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動很敏感,易出現(xiàn)運(yùn)動偽影。目前,快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動偽影而被普遍的使用。雙光子顯微鏡采用長波長激發(fā)。
比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出,基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如,正電子發(fā)射斷層成像(PET)可實現(xiàn)對分子代謝的成像,空間分辨率∶1-2mm,時間分辨率;分鐘量級。與PET比較,光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣(可測量更多的參數(shù),請參見表1-1),且具有更高的時間分辨率(秒級),空間分辨率可達(dá)到微米。因此,二者相比,雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET,但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物(如小白鼠)研究來說,光學(xué)成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達(dá)成像。例如,初步研究表明,熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實時在體成像。雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。美國共聚焦多光子顯微鏡代理商
多光子顯微鏡適用于動物大腦皮層深層(400微米)細(xì)胞的形態(tài)、生理學(xué)研究。美國進(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析
多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā),光散射?。ㄐ×W拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比)。不需要***,能更多收集來自成像截面的散射光子。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子,多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減,不易對深層激發(fā)。多光子熒光成像的特點。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,所以顯微試樣中的瑞利散射更小,熒光測定的信噪比更高。觀察活細(xì)胞∶離子測量(i.e.Ca2+),GFP,發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,能對細(xì)胞長時間觀察。美國進(jìn)口多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析