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qPCR第三方檢測方法的分析驗(yàn)證有哪些內(nèi)容？效率不僅是 PCR 效率，還包含反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription，RT）的效率。RT 效率是指 RNA 合成 cDNA 的效率，如果 1,000 個(gè) RNA 分子變成 1,000 個(gè) cDNA 分子，效率就是 100% ，實(shí)際上很多 RT 酶的效率對于不同濃度的 RNA 樣本存在差異，這樣 cDNA 擴(kuò)增后的結(jié)果并不能真實(shí)反映樣品中 RNA 的水平。PCR 效率是指 DNA 在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中復(fù)制的效率，每個(gè)循環(huán)增加 2 倍，其效率就是 100% ，這也和所選試劑、引物、模板質(zhì)量密切相關(guān)。梯度稀釋實(shí)驗(yàn)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線可直觀地顯示各濃度理論值和測得的 Cq 值的相關(guān)性，其中 R2 值表示各個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是否正好落在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，當(dāng) R2 < 0.98 時(shí)，表明數(shù)據(jù)偏差較大。
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磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實(shí)操過程中有哪些注意事項(xiàng)？細(xì)節(jié)決定成敗，在科研中更是如此。1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。2.加一抗后比較好4度過夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。二抗則室溫1小時(shí)即可。3.磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。務(wù)必找專業(yè)的磷酸化抗體公司訂購。4.比較好根據(jù)廠商的protocol來操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會有不同要求。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)第三方檢測報(bào)告
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