磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實(shí)操過程中有哪些注意事項(xiàng)？研究完某一蛋白的磷酸化情況后比較好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。如壓完 phospho-p38 抗體后，我會(huì)把相同的 membrane 做 strip 后再壓 p38, 然后再 strip 一次，再壓內(nèi)標(biāo) actin 。做磷酸化蛋白 WB 時(shí)，除了目標(biāo)蛋白的 band 以外，往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的 band. 磷酸化抗體不好的話，甚至?xí)撼龇翘禺愋缘?band, 而沒有你想要的 band, 所以壓片以后，一定要根據(jù) markers 比對一下，壓出的 band 分子量是否正確。 磷酸化蛋白 WB 時(shí) backgroud 也往往較深，所以壓片時(shí)間要適當(dāng)，不能太長或過短，太長則 backgroud 太深蓋住想要的那條 band, 時(shí)間過短則可能沒有 band 或者 band 太淺。磷酸化蛋白 WB 時(shí)，要用TBST，不能用PBST。用 TBST 洗時(shí)也要注意一下，搖床的轉(zhuǎn)速不要太快，洗的時(shí)間不要太長，孵育一抗和二抗之后分別洗 5min 3 次即可，寧愿 background 深一些，總比做不出來強(qiáng)得多 . 另外，洗的時(shí)候，比較好不要把幾張 membrane 疊在一起洗。成都瑞普信生物技術(shù)有限公司是專業(yè)的第三方基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)檢測服務(wù)商。自貢慢病毒載體第三方檢測方法
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“做miRNA下調(diào)，QPCR檢測miRNA，表達(dá)水平無變化”，這到底是怎么回事？現(xiàn)有miRNA抑制手段，無論是基于載體構(gòu)建的、還是化學(xué)合成的，本質(zhì)上都是用跟成熟體互補(bǔ)的反義miRNA（miRNA海綿體屬于不完全互補(bǔ)的反義RNA重復(fù)），其可以通過結(jié)合miRNA，阻斷其與靶基因結(jié)合，但并不能有效引發(fā)miRNA的降解，原因有兩方面：其一是反義RNA與miRNA結(jié)合后，序列很短，導(dǎo)致Dicer酶（細(xì)胞內(nèi)降解雙鏈RNA的主角）不能有效結(jié)合；其二是miRNA與Ago2以RISC復(fù)合物的形式存在，該復(fù)合物也會(huì)導(dǎo)致Dicer酶無法高效結(jié)合。因此，如果以反義RNA技術(shù)抑制miRNA功能，QPCR可以做，如果檢測出表達(dá)水平下降還好，即便未檢測到，也不表示抑制無效，正確的做法是直接檢測目的基因蛋白水平是否有上調(diào)。但若實(shí)驗(yàn)者不清楚靶基因的情況下，不檢測到miRNA下調(diào)，心里是沒底的。自貢慢病毒載體第三方檢測方法
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