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GSDME全長蛋白在切割前是沒有活性的，N端和C端結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用調(diào)控自抑制。caspase-3可以將全長GSDME，剪切成有活性的N端（包含1-270a段的GSDME-N）和C端（GSDME-C）。如果需檢測到N端或者C端的GSDME片段，細(xì)胞通常需要誘導(dǎo)處理。在檢測GSDME全長時(shí)需注意，其表達(dá)水平因樣品類型（組織和細(xì)胞）而異，可能在部分組織和細(xì)胞株系表達(dá)，其表達(dá)水平也存在差異，因此需要對樣品處理和WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一些優(yōu)化。建議設(shè)置陽性和陰性對照。并且組織樣本成分更復(fù)雜，在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)可能出現(xiàn)多條條帶現(xiàn)象。瑞普信靠譜第三方檢測WB，QPCR，ELISA，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
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“做miRNA下調(diào)，QPCR檢測miRNA，表達(dá)水平無變化”如何解決呢？反義核酸是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能，要阻斷miRNA的產(chǎn)生，理想情況是在生成成熟的miRNA之前阻斷。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能實(shí)現(xiàn)，Cas9通過在pre-miRNA序列中引入突變，從而破壞miRNA表達(dá)，是miRNA基因功能缺失研究的一種新方法。福建肖老師運(yùn)用Cas9技術(shù)，針對miR-21基因設(shè)計(jì)sgRNA ，通過慢病毒遞送細(xì)胞，并在RNA水平檢測到mir-21的下調(diào)表達(dá)，從而研究出miR-21耗竭對CNE2鼻咽（NPC）細(xì)胞生物學(xué)特性及其潛在機(jī)制的影響。使用Cas9敲除miR-21之后，功能上也呈現(xiàn)出陽性，此外，溫醫(yī)大醫(yī)院的張老師使用Cas9敲除mir-545，研究了人環(huán)狀RNA PRKCI（circPRKCI）通過抑制miR-545顯示致性，促進(jìn)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的病理進(jìn)展3。所以，CRISPR / Cas9對于miRNA的KO是有效的、被認(rèn)可的、且以QPCR檢測表達(dá)量完全沒有問題。陜西生化法第三方檢測公司推薦
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