上海酶定向進化技術(shù)服務(wù)開發(fā)

除了CRISPR-Cas9技術(shù)，還有其他幾種基因編輯技術(shù)可以用于金黃色葡萄球菌的研究：1.**單堿基編輯技術(shù)**：這是一種新型的基因編輯技術(shù)，可以在不切割DNA雙鏈的情況下實現(xiàn)基因的定點突變。季泉江教授課題組與中國科學(xué)院北京基因組所韓大力研究員課題組合作，在金黃色葡萄球菌中建立了單堿基編輯技術(shù)，通過融合失活的Cas9蛋白（Cas9D10A）和胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），實現(xiàn)了高效單堿基編輯，有助于研究耐藥機制和開發(fā)新型手段。2.**同源重組（HR）修復(fù)技術(shù)**：在某些細菌中，可以通過同源重組機制對CRISPR-Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的雙鏈DNA斷裂進行修復(fù)，實現(xiàn)基因的精確編輯。例如，在谷氨酸棒桿菌中，利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合同源重組修復(fù)模板，實現(xiàn)了高效的基因缺失和點突變。3.**非同源末端連接（NHEJ）相關(guān)蛋白共表達**：通過共表達Cas9蛋白和NHEJ相關(guān)蛋白，如連接酶LigD，可以在鏈霉菌中實現(xiàn)有效的基因組編輯，這種方法不依賴于同源重組，可以應(yīng)用于那些同源重組效率較低的細菌。4.**CRISPR干擾技術(shù)（CRISPRi）**：利用失活的Cas9蛋白（dCas9）阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制特定基因的表達。這種技術(shù)可以用于研究基因功能和調(diào)控基因表達，已經(jīng)在多種細菌中得到應(yīng)用。有研究者反映pCas/pTargetF在某些大腸桿菌菌株如BL21(DE3)中編輯不理想，體現(xiàn)為無法獲得轉(zhuǎn)化子。上海酶定向進化技術(shù)服務(wù)開發(fā)

除了His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，還有多種融合伴侶技術(shù)可以用于提高蛋白的表達和純度，包括但不限于以下幾種：1.**Flag標(biāo)簽**：Flag是一個八肽序列(DYKDDDDK)，可以通過抗Flag標(biāo)簽的抗體進行免疫沉淀或西方印跡分析，有助于提高蛋白的純度。2.**Fc融合蛋白**：Fc標(biāo)簽是免疫球蛋白的恒定區(qū)，可以提高蛋白在哺乳動物細胞中的溶解性和穩(wěn)定性，并且可以通過蛋白A親和層析進行純化。3.**人血清白蛋白(HSA)**：HSA作為融合伴侶可以提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性，延長半衰期，并通過其固有的結(jié)合特性進行純化。4.**轉(zhuǎn)鐵蛋白**：轉(zhuǎn)鐵蛋白可以作為融合伴侶，利用其與鐵的高親和力進行純化，并且有助于提高蛋白的穩(wěn)定性。5.**XTEN聚合物**：XTEN是一種柔性的多肽聚合物，可以提高蛋白的溶解性和穩(wěn)定性，有助于防止聚集。6.**彈性蛋白樣多肽(ELP)**：ELP具有可逆的熱響應(yīng)性質(zhì)，可以通過溫度誘導(dǎo)的相分離進行純化，有助于提高純度。7.**Strep標(biāo)簽**：Strep標(biāo)簽是一個短肽序列，可以通過Strep-Tactin親和層析進行高效率的純化。8.**MBP融合蛋白**：麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)可以作為融合伴侶，提高蛋白的溶解性，并通過親和層析進行純化。。北京人源膠原蛋白開發(fā)技術(shù)服務(wù)研發(fā)sgRNA質(zhì)粒丟失了，這時候含有Kan的這一管菌液就可以用于接種制備感受態(tài)細胞，進行下一輪編輯。

重組蛋白表達服務(wù)是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要分支，它涉及到使用各種生物表達系統(tǒng)來生產(chǎn)特定的重組蛋白，這些蛋白通常用于臨床前研究、藥物開發(fā)、疫苗制備等。以下是重組蛋白表達服務(wù)在臨床前研究中的一些關(guān)鍵應(yīng)用和技術(shù)要點：1.**目標(biāo)蛋白的選擇與設(shè)計**：-根據(jù)研究目的選擇合適的目標(biāo)蛋白，可能包括蛋白、酶、抗體、病毒抗原等。-設(shè)計蛋白序列時，可能需要進行突變、融合標(biāo)簽或優(yōu)化密碼子以提高表達效率。2.**表達系統(tǒng)的選取**：-選擇適合目標(biāo)蛋白的表達系統(tǒng)，如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等，每個系統(tǒng)都有其特定優(yōu)勢和局限性。3.**載體構(gòu)建**：-構(gòu)建含有目標(biāo)蛋白基因的表達載體，選擇合適的啟動子、標(biāo)記基因和抗性基因。4.**蛋白表達與優(yōu)化**：-將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，進行蛋白表達。-通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件、培養(yǎng)時間和溫度等參數(shù)來提高蛋白的表達量和可溶性。5.**翻譯后修飾**：-根據(jù)蛋白的功能需求，進行必要的翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化等。6.**蛋白純化**：-使用色譜等技術(shù)對表達的蛋白進行純化，確保蛋白的純度和活性。7.**功能性驗證**：-對純化后的蛋白進行功能性驗證，確保其生物學(xué)活性和穩(wěn)定性。

Thioredoxin-NP-27是一種腸激酶的底物，用于檢測腸激酶的活性。它是由硫氧還蛋白和NP-27融合而成，中間通過腸激酶的酶切位點（DDDDK）連接。這種底物在經(jīng)過腸激酶酶切后，可以通過SDS-PAGE電泳觀察到分子量分別為18kDa和27kDa的兩條帶。腸激酶是一種高度專一性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列的蛋白酶，它在Lys的C端水解多肽。腸激酶可以將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橐让?，也可以將帶有這個識別序列的融合蛋白切開。在37℃，16小時內(nèi)將0.5mg的反應(yīng)底物Thioredoxin-NP-27切割為NP-27達95%所需的酶量定義為一個單位。腸激酶的活性單位定義為在37℃，16小時內(nèi)將0.5毫克的Thioredoxin-NP-2795%降解為NP-27所需要的酶量。這種酶在基因工程產(chǎn)品開發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用，特別是作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂。Thioredoxin-NP-27產(chǎn)品的優(yōu)勢在于它符合GB/T41907-2022標(biāo)準(zhǔn)，適用于腸激酶活性檢測的底物。產(chǎn)品保存條件為-30~-15℃，運輸條件為≤0℃，以確保其穩(wěn)定性和活性。使用時，應(yīng)按照產(chǎn)品說明進行操作，并注意安全防護措施。我們的服務(wù)內(nèi)容包括：從上游細胞培養(yǎng)、下游蛋白純化到制劑灌裝、成品包裝等GMP生產(chǎn)服務(wù)。

單堿基編輯技術(shù)在金黃色葡萄球菌研究中的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)如下：**優(yōu)勢**：1.**高效性**：單堿基編輯技術(shù)可以在不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)基因組中單個堿基的轉(zhuǎn)換，如將C?G轉(zhuǎn)變?yōu)門?A或A?T轉(zhuǎn)變?yōu)镚?C，這使得它在基因編輯中具有較高的效率。2.**精確性**：該技術(shù)通過CRISPR/Cas系統(tǒng)實現(xiàn)DNA的定位，提高了基因編輯的準(zhǔn)確性，減少了非目標(biāo)效應(yīng)，這對于研究特定基因功能和遺傳性疾病至關(guān)重要。3.**操作簡便**：單堿基編輯技術(shù)不需要復(fù)雜的蛋白質(zhì)設(shè)計或同源重組修復(fù)模板，簡化了實驗操作流程。**挑戰(zhàn)**：1.**脫靶效應(yīng)**：盡管單堿基編輯技術(shù)具有高特異性，但仍存在一定的脫靶風(fēng)險，需要通過優(yōu)化sgRNA設(shè)計和篩選策略。2.**編輯窗口限制**：單堿基編輯技術(shù)的編輯窗口通常較寬，限制了其在某些精細調(diào)控場合的應(yīng)用，需要進一步研究以縮小編輯窗口。3.**技術(shù)優(yōu)化需求**：為了提高單堿基編輯技術(shù)在金黃色葡萄球菌中的效率和應(yīng)用范圍，需要進一步對編輯系統(tǒng)進行優(yōu)化，包括提高編輯器的純度和擴展靶向范圍。4.**體內(nèi)遞送挑戰(zhàn)**：在實際應(yīng)用中，如何有效地將單堿基編輯系統(tǒng)遞送到目標(biāo)細胞或組織，同時減少免疫原性反應(yīng)，是實現(xiàn)其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一。我們的GMP蛋白穩(wěn)定細胞系開發(fā)服務(wù)涵蓋從細胞線構(gòu)建到鑒定和驗證的全過程，為您提供一站式解決方案。黑龍江重組人源膠原蛋白技術(shù)服務(wù)臨床前研究

利用基因編輯技術(shù)對粘質(zhì)沙雷氏菌進行精細基因調(diào)控，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。上海酶定向進化技術(shù)服務(wù)開發(fā)

漢遜酵母表達系統(tǒng)是一種新型的酵母菌表達平臺，它具有高密度培養(yǎng)和高效表達外源蛋白的能力。在臨床前研究中，漢遜酵母被用于表達瘤病毒（HPV）病毒樣顆粒（VLPs），這為開發(fā)HPV疫苗提供了一種有希望的策略。HPVB19是一種高度傳染性的病毒，對免疫功能低下者和胎兒可能造成嚴重后果。目前，尚無針對HPVB19的批準(zhǔn)疫苗或抗病毒藥物，因此開發(fā)有效的疫苗顯得尤為重要。漢遜酵母表達的VLPs，特別是VP1與VP2共組裝的VLP(VP1/VP2VLP)，可能成為HPVB19疫苗開發(fā)的候選免疫原。在一項研究中，漢遜酵母成功表達了HPV68bL1蛋白，并形成了VLPs。這些VLPs在小鼠模型中顯示出良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度的中和抗體，并且對HPV68a型也表現(xiàn)出一定的交叉保護作用。這表明漢遜酵母表達的HPV68bVLPs可能作為多價HPV疫苗的組分，用于疫苗生產(chǎn)。漢遜酵母表達系統(tǒng)還提供了一整套從表達載體構(gòu)建到產(chǎn)業(yè)化發(fā)酵和蛋白純化的通用技術(shù)平臺，適合不同規(guī)模的企業(yè)使用。在HPV68bL1蛋白的VLPs研究中，通過高密度發(fā)酵和系列純化步驟，獲得了純度超過95%的VLPs，這些VLPs在形態(tài)上與天然病毒顆粒相似，并通過假病毒體外中和試驗證明了其免疫學(xué)效果。上海酶定向進化技術(shù)服務(wù)開發(fā)