單細胞RNA-seq、RNA-seq和逆轉(zhuǎn)錄qPCR（RT-qPCR）都采用一個共同過程，即分離RNA并將其轉(zhuǎn)化為cDNA進行分析。不過，每種分析在開展方式和獲得的數(shù)據(jù)上有所不同。RNA-seq和RT-qPCR都是先從大量細胞中分離RNA，然后將其轉(zhuǎn)化為cDNA。RNA-seq是使用cDNA來構(gòu)建新一代測序文庫，從而測定整個轉(zhuǎn)錄組的基因表達。RT-qPCR則是從cDNA中擴增特定靶點，并通過熒光測定表達水平。RT-qPCR限于已知靶點，而RNA-seq可實現(xiàn)無偏倚的全轉(zhuǎn)錄組基因表達分析。然而，這兩者只能提供細胞群體內(nèi)基因表達的平均情況。單細胞RNA-seq則在分離RNA之前將單細胞分離到微孔或單個微反應(yīng)容器中。然后用細胞特異性的條形碼標記RNA，確保來自每個細胞的cDNA可以追溯到起源細胞。與RNA-seq相似，帶有條形碼的cDNA也被用于構(gòu)建新一代測序文庫，從而能夠?qū)γ總€細胞的整個轉(zhuǎn)錄組進行基因表達測定。烈冰單細胞測序，助力您的深入科學(xué)探究。南京二代測序單細胞測序服務(wù)
針對樣本活性的問題，10×Genomics官方建議當(dāng)單細胞懸液活性低于70%時應(yīng)做去除死細胞操作，但也需要注意到，去除死細胞的操作會損失一定的細胞數(shù)量，10×Genomics和MiltenyiBiotec都沒有給出單細胞懸液含有多少細胞數(shù)量才建議做去除死細胞的操作?；诹冶嗄陠渭毎麥y序?qū)嶒灲?jīng)驗，建議當(dāng)細胞懸液進行質(zhì)量和活性檢測后，考慮對細胞活性在50%-70%的懸液進行去除死細胞的操作。而太低活性的懸液（小于30%），懸液中細胞大量死亡，可能已經(jīng)丟失了原組織內(nèi)的細胞比例和狀態(tài)，失真嚴重，建議重新收集樣本進行新的實驗，保證數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和實驗結(jié)果的準確性。上海烈冰單細胞測序烈冰對于一個細胞群體中的每個細胞單獨進行建庫測序分析。
樣本制備后的保存為了盡可能地減少轉(zhuǎn)錄組的變化，在對細胞進行清洗和計數(shù)后，單細胞懸液應(yīng)當(dāng)保存于冰上，直至用于后續(xù)的上機和文庫制備步驟。在理想狀況下，一旦制備好樣本，應(yīng)當(dāng)在3min鐘內(nèi)將其用于下游步驟。然而，您還有必要了解各類細胞的不同性質(zhì)，因為這可能會影響細胞應(yīng)在冰上保存的時間，以及它們在制備后多久便應(yīng)當(dāng)被盡快使用。例如，有些細胞（如PBMC）如果在冰上放置一段時間，它們就開始形成團塊。這些團塊很難解離，增加了堵塞的風(fēng)險，而且每個團塊被當(dāng)成單細胞計數(shù)，又降低了細胞計數(shù)的準確性。此外，有些細胞更加粘稠，形成團塊的速度更快。對于這些細胞，必須盡量減少制備和使用之間的時間差
細胞中基因的表達是嚴格按照時間和空間順序發(fā)生，因此細胞類型和基因表達具有時間特異性和空間特異性。時間特異性可以通過收集不同時間點的樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序來分析。但是單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-Seq）在單細胞懸液制備的過程中破壞了細胞的空間結(jié)構(gòu)，無法給出固態(tài)異質(zhì)化組織中細胞空間排布信息。而空間轉(zhuǎn)錄組可以解決這個問題，其以點陣形式記錄組織切片細胞的空間信息，在保留組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，獲得細胞/基因的空間表達特異性。截至2021年10月，烈冰助力發(fā)表單細胞測序文章近20篇。
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單細胞測序技術(shù)提供了單個細胞水平下的科學(xué)研究視角。南京二代測序單細胞測序服務(wù)
10XGenomics和Drop-Seq具有類似的技術(shù)原理。從橫向孔道中逐一輸入凝膠微珠，一列縱向孔道輸入細胞，凝膠微珠與細胞碰撞后會吸附在凝膠微珠上，并通過微流控技術(shù)，將之輸入到第二縱向孔道，即油相孔道中。這時候，就形成了一個個油滴并輸出并收集在EP管中。每一個油滴中會落入一個細胞以及一個凝膠微珠，那么在每一個凝膠微珠中上長滿了不同的CellBarcode和UMIBarcode連接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，構(gòu)成我們的捕獲凝膠微珠。而這個凝膠微珠抓手就會使用oligodT抓住mRNA構(gòu)建文庫。南京二代測序單細胞測序服務(wù)
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