聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。山東高精確度數(shù)字PCR方案
該技術(shù)提出至今雖然只有十幾年時間，但是由于其獨特的技術(shù)優(yōu)勢和應(yīng)用前景，使得其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展相當(dāng)迅速。迄今為止，已有包括Fluidigm和 Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字 PCR 產(chǎn)品，并已經(jīng)應(yīng)用于單細(xì)胞分析、**早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域。目前，有關(guān)數(shù)字 PCR 技術(shù)的綜述類文獻(xiàn)并不多見，本文將在現(xiàn)有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，對該技術(shù)的原理、定量方法、分類及應(yīng)用進行評述，并對發(fā)展趨勢進行展望。數(shù)字 PCR 技術(shù)提出至今，相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今為止，數(shù)字 PCR 技術(shù)主要有三類: 微反應(yīng)室/孔板、大規(guī)模集成微流控芯片和液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。廣東高精確度數(shù)字PCR整個實驗流程可在2小時內(nèi)完成。
甲基化含量鑒定：傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等受限于方法學(xué)的問題，不能獲得甲基化程度的精確定量，而數(shù)字PCR系統(tǒng)通過對樣品的微液滴處理及目標(biāo)分子的***拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種可靠的技術(shù)。二代測序輔助建庫：目前靶向測序建庫方法包括擴增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴增引物增加時，由于擴增引物之間的相互作用，從而影響擴增的效率；如果將其分散到大量微液滴中擴增，將可**降低引物間相互作用，提高擴增效率。同時還可以實現(xiàn)對于少量模板的有效擴增，得到更多的有效測序數(shù)據(jù)。
拷貝數(shù)變異(CNV)研究：數(shù)字PCR直接讀取陽性信號，通過泊松分布校正得到目標(biāo)基因的***拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了***的檢測精度。采用數(shù)字PCR能夠有效對二代測序（NGS）和微陣列比較基因組雜交（aCGH）等實驗結(jié)果進行驗證，并具有檢測周期短、成本低、樣本通量高等特點。低豐度DNA模板分子的精確定量：由于絕大部分微液滴中只含單個或不含模板分子，使得低豐度DNA模板分子的擴增不受高豐度模板分子擴增的競爭抑制：與此同時，樣品中可能存在的抑制劑也在分配到微液滴的過程中進行了相對稀釋，作用于單個微液滴內(nèi)模板擴增的抑制劑數(shù)量大幅降低，從而提高PCR擴增對抑制劑的耐受程度，因此可應(yīng)用于諸多臨床樣品（如血液、尿液、糞便、痰液、胸腹水、腦脊液等）中痕量核酸標(biāo)記物的檢測。一般而言，定量PCR的檢測靈敏度約在1%，NGS的靈敏度可達(dá)到1%，而數(shù)字PCR的檢測下限可輕松實現(xiàn)0.01%?？梢杂脕頇z測外泌體micRNA。
肺*的ALK融合基因檢測：ALK融合基因是NSCLC患者另外一個常規(guī)的伴隨診斷，可以指導(dǎo)ALK-TKI藥物的使用，目前已發(fā)現(xiàn)20種以上EML4-ALK的融合形式，多個報道證實它們中大部分能促進**生成。另外ALK還可能與TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因發(fā)生融合，因此ALK融合突變的診斷具有一定難度。目前臨床常規(guī)使用的檢測手段包括免疫組化（Immunohistochemistry，IHC），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）以及RT-PCR等三種。這三種方法各具優(yōu)缺點：IHC相對簡單，價格低廉，但是容易受到主觀判斷的影響；FISH可以檢測各種融合類型，但是操作繁瑣，價格昂貴；RT-PCR方法的特異性較好，結(jié)果客觀，但是只能針對已知類型。近期有研究者采用數(shù)字PCR，利用ALK基因3’端的過表達(dá)來鑒定ALK的融合，該方法既具有PCR方法特異性好、結(jié)果客觀的優(yōu)勢，同時又不受融合類型的限制，可以檢測所有融合型，在與三種傳統(tǒng)方法的對比過程中展現(xiàn)出了更好的臨床符合率，未來有望成為一種新的常規(guī)檢測手段。開發(fā)多靶點檢測的多重數(shù)字PCR檢測，可以通過多種熒光染料或標(biāo)記技術(shù)來實現(xiàn)。云南數(shù)字PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)
對引物的特異性要求高。山東高精確度數(shù)字PCR方案
CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗證：CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗證實驗是否成功，仍需要高靈敏度的檢測方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團隊發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對核酸進行高靈敏度的定性檢測，但精確定量評估時仍采取了數(shù)字PCR進行確認(rèn)。*****的伴隨診斷：常用體液來源（如血液，胸腹水，唾液及尿液等）的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實現(xiàn)**標(biāo)記物的有效檢測，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺*/胃*的HER2基因擴增檢測等，應(yīng)用于**精細(xì)醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。山東高精確度數(shù)字PCR方案