industryTemplate常見的300種人、小鼠和大鼠基因表達Assay均已在QIAcuity數(shù)字PCR平臺上經(jīng)過驗證。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；（2）高靈敏度，可實現(xiàn)單分子級檢測；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對罕見的目標(biāo)分子進行檢測；（4）高穩(wěn)定性，對抑制劑的耐受程度**增強。憑借這些優(yōu)勢，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個不同的領(lǐng)域[4]，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測、基因拷貝數(shù)變異檢測、基因表達研究、甲基化水平檢測、**液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測、微生物（病毒、細菌等）檢測、移植排斥監(jiān)控和二代測序輔助建庫等。此外，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。PCR數(shù)字PCR共同合作一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進行反應(yīng)。
值得注意的是，在gDNA長度≥20kb或進行拷貝數(shù)變異檢測實驗時，必須對樣品進行酶切處理，確保大片段DNA序列或串聯(lián)序列在酶切處理后，模板隨機且均勻的進入**反應(yīng)體系，以實現(xiàn)準(zhǔn)確和精確的定量。數(shù)字PCR實驗離不開包含有Mg2+、dNTP、Buffer和DNA聚合酶等PCR反應(yīng)所需要的MasterMix。隨著實驗的不斷深入，對于實驗條件的要求也不斷提高，其中DNA聚合酶對實驗的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。由于非熱啟動的DNA聚合酶在反應(yīng)體系易使引物在室溫條件下發(fā)生非特異性擴增，直接影響實驗結(jié)果。
20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)***定量分析。通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應(yīng)體系進行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應(yīng)以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽性微滴個數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現(xiàn)高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性。影響引物探針特異性的因素有很多種，譬如純化方式、設(shè)計方法以及引物探針的修飾技術(shù)等。PCR數(shù)字PCR共同合作
開發(fā)多靶點檢測的多重數(shù)字PCR檢測，可以通過多種熒光染料或標(biāo)記技術(shù)來實現(xiàn)。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)
單細胞的基因表達分析：基因表達分析有助于了解細胞和組織的特征及其如何應(yīng)對發(fā)育和環(huán)境信號的改變。檢測已知和未知基因轉(zhuǎn)錄水平的方法在過去的四十多年來發(fā)生了翻天覆地的變化，變得更加有效，更加敏感，定量更加精細，能夠一次性對大量的基因轉(zhuǎn)錄本進行分析。但是，在組成復(fù)雜的細胞混合物中，盡管***表達的基因可以被識別出來，但來自于少數(shù)細胞群體（例如干細胞）的轉(zhuǎn)錄本卻很可能會被掩蓋掉，尤其是在每個細胞中以低豐度形式出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。為了解決這個問題，單細胞檢測技術(shù)應(yīng)用而生，而且逐漸受到了越來越多的重視。ddPCR在單細胞分析中的優(yōu)勢在于它不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線就能進行***定量。而且，由于能夠以非常高的敏感性區(qū)分至少五種不同的基因轉(zhuǎn)錄本，因此無需進行其他方法所要求的單細胞cDNA預(yù)擴增，這可以消除預(yù)擴增和NGS文庫準(zhǔn)備中潛在的轉(zhuǎn)錄本定量失真，能夠能加真實的反映單細胞群體中關(guān)鍵基因的特征。天津Digital PCR數(shù)字PCR服務(wù)