甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)
通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異，因此DNA樣本經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異，這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn)。使用該方法進行甲基化分析*需一對引物，相對簡單，不過這種方法對儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，并且在進行實時定量PCR過程中，需要使用飽和的熒光染料。利用MS-HRM技術(shù)進行甲基化檢測只能對檢測片段整體甲基化情況進行分析，并不能明確每個CpG位點的甲基化狀態(tài)。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測，篩選出感興趣的CPG位點，然后利用其他方法進行單個位點的精確檢測及甲基化程度的精確定量。 人類基因組有約56M的CpG位點，CpG島約3萬個。MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗豐富
Agilent甲基化芯片通過SurePrint芯片合成**技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化的探針設(shè)計及實驗方法，可靈活進行甲基化研究，得到高靈敏度、高特異性、高重復(fù)性的結(jié)果。技術(shù)流程：1.將基因組DNA超聲打斷成400-500bpDN**段；2.加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份；3.其中一份單鏈DNA樣品加入抗5'-甲基化胞嘧啶核苷抗體。使用免疫磁珠法分離樣品中甲基化DN**段的抗體復(fù)合物，樣品中其余的非甲基化DN**段被洗脫；4.純化免疫共沉淀的DN**段；對MeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進行標(biāo)記；5.標(biāo)記后的MeDIP與Input樣品混合、變性，與芯片雜交；6.檢測雜交信號并進行數(shù)據(jù)分析。芯片種類：Agilent**甲基化芯片，8x60K●和合作伙伴在Agilent公司定制的Promoter芯片?！窠^大多數(shù)基因是針對基因啟動子區(qū)域的CpG島設(shè)計探針?！裥酒弦还灿?160個功能注釋比較明確的基因，其中2128個和**發(fā)生有關(guān)系?！駨墓δ苌戏?，有256基因和細(xì)胞凋亡有關(guān)，1273個基因和信號傳導(dǎo)有關(guān)，487個基因和壓力和衰老有關(guān)?！裉貏e適用于**甲基化研究。 江蘇6mA技術(shù)服務(wù)歡迎咨詢高通量BSP測序結(jié)果多種展示形式。
甲基化是表觀修飾的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA構(gòu)象、穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因表達(dá)。DNA鏈中含有很多CpG結(jié)構(gòu)，雙鏈DNACpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因組中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出現(xiàn)在基因啟動子**序列或者轉(zhuǎn)錄起始位點。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶可以催化CpG的甲基化反應(yīng)。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶有兩種，Dnmt1是一種持續(xù)性甲基化轉(zhuǎn)移酶，作用于只有一條鏈甲基化的DNA雙鏈，使其完全甲基化，參與DNA復(fù)制過程中新合成鏈的甲基化修飾；Dnmt3a/Dnmt3b是一種從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，可以在CpG上產(chǎn)生新的甲基化修飾，首先半甲基化，繼而全甲基化，該甲基化轉(zhuǎn)移酶可能參與細(xì)胞生長分化的調(diào)控，在**基因甲基化中起到重要作用。近年來CRISPR/Cas9技術(shù)得到快速發(fā)展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一個Dnmt3a，能夠通過dCas9介導(dǎo)特定位點的甲基化修飾，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。
隨著二代測序技術(shù)的告訴發(fā)展，測序成本大幅度下降，使得真正實現(xiàn)全基因組甲基化分析的研究成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經(jīng)陸續(xù)有多個物種的甲基化圖譜構(gòu)建完成。研究者將傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測方法，如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測序相結(jié)合，可以實現(xiàn)單堿基精度的甲基化圖譜的構(gòu)建。此外將成熟的MeDIP技術(shù)與二代測序相結(jié)合，可以快速有效地尋找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病樣本間的DNA甲基化修飾模式的差異。因此該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀研究。第三代測序技術(shù)的出現(xiàn)，更是讓甲基化的直接測定成為可能。一年前，美國PacificBiosciences公司利用獨有的單分子實時(SMRT)測序技術(shù)，直接測定了DNA的甲基化。這項成果發(fā)表在《NatureMethods》雜志上。 云生物提供測序服務(wù)。
Agilent平臺因為MeDIP技術(shù)本身的特點，都不能到達(dá)單堿基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate檢測技術(shù)卻做得到。Illumina的Infinium甲基化檢測技術(shù)來源與前期的SNP檢測，采用的是單堿基延伸的原理。分析利用兩個位點特異的探針檢測這些序列差異的位點，一個探針是為甲基化位點(M磁珠類型)設(shè)計的，而另一個是為未甲基化位點(U磁珠類型)設(shè)計的。探針的單堿基延伸摻入了一個標(biāo)記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計算甲基化與未甲基化位點的熒光信號比例，可確定檢測位點的甲基化水平。Illumina公司早期推出的InfiniumHumanMethylation27BeadChip芯片覆蓋27,578個CpG位點。這款芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有***的應(yīng)用，除了和**相關(guān)的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢測。因此對這款產(chǎn)品，研究者給予了很高的評價，目前此產(chǎn)品已停產(chǎn)，取而代之的是InfiniumHumanMethylation450BeadChip芯片。它以單堿基分辨率覆蓋了基因組中超過45萬個甲基化位點，實現(xiàn)了基因區(qū)域和CpG島的***覆蓋。此外，還包括CpG島之外的CpG位點，在人類干細(xì)胞中鑒定出的非CpG甲基化位點，以及**和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價格。 850K芯片為半金標(biāo)準(zhǔn)，價格低，分析簡單，較為適合EWAS類型的課題。MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗豐富
CpG島常位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近。MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗豐富
芯片平臺作為目前比較成熟的篩選工具，已經(jīng)在很多領(lǐng)域有了相應(yīng)的應(yīng)用。多家芯片公司在DNA甲基化這塊兒有了相應(yīng)的產(chǎn)品提供，其中應(yīng)用**為***的就Agilent平臺和Illumina平臺，相應(yīng)的產(chǎn)品包括AgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit，InfiniumHumanMethylation27BeadChip和InfiniumHumanMethylation450KBeadChip。另外RocheNimbleGen和Affymetrix也有相應(yīng)的芯片推出，但是NimbleGen的芯片今年下半年已經(jīng)停產(chǎn)。不同的芯片平臺，各自的實驗過程也是不一樣的。安捷倫前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)。將基因組DNA分成兩份，一份用來做MeDIP，另一份作為對照。兩個樣品都標(biāo)記熒光(富集的樣品用Cy5標(biāo)記，對照用Cy3標(biāo)記)，然后與芯片雜交。芯片上每個探針的Cy5/Cy3強度比例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。 MeDIP-Seq技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗豐富