微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個實現(xiàn)低成本、小體積和高通量平行PCR分析的理想平臺。2000年，Unger等采用多層軟刻蝕 ( multilayer soft lithography，MSL) 技術(shù)在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上設(shè)計并加工高密度微泵微閥結(jié)構(gòu)(如圖2b所示) ，他們將這種芯片稱為IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高彈性的特點，通過多層軟刻蝕技術(shù)在芯片上加工交織的液體和氣體通道結(jié)構(gòu)，可以快速并準(zhǔn)確地將流體分成若干個**的單元，進行多步平行反應(yīng)。2006 年Ottesen等將IFC芯片用于數(shù)字PCR分析，通過精細控制微泵微閥的開啟和關(guān)閉，一步操作即可將一個樣本平均分配到 1176個反應(yīng)單元中，每個反應(yīng)單元的體積只有6. 25 nl，成功代替了傳統(tǒng)點樣儀和384孔板。他們同時進行了6個樣本7 056個單元的平行數(shù)字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技術(shù)加工了具有10^6個結(jié)構(gòu)單元的數(shù)字PCR 芯片，每個反應(yīng)單元的體積降低至10 pl，芯片密度達到 440000 /cm2。與微反應(yīng)室數(shù)字PCR系統(tǒng)相比，IFC的特點是通量更高，每個反應(yīng)單元的體積更小，加樣更快。**近，Men等在2mm×2mm區(qū)域內(nèi)加工了82000個 fl 級反應(yīng)單元，進行數(shù)字PCR分析。DNA聚合酶對實驗的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬個微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個微滴。ddPCR原理是通過將一個待分析的PCR反應(yīng)體系進行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個油包水小微滴從而對原始體系進行分割，樣品中的核酸分子隨機分配到大量**的微滴中，每個微滴中含有一個或不含待檢核酸分子。對微滴體系進行擴增反應(yīng)以后，分析每個微滴的熒光信號，進行有或無的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽性微滴個數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實現(xiàn)高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性。湖北準(zhǔn)確數(shù)字PCR活動良好的引物探針設(shè)計是數(shù)字PCR實驗獲得成功的關(guān)鍵因素之一。
20 世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行統(tǒng)計學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)***定量分析。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展。特別是90年代后期，美國ABI公司推出的實時熒光定量PCR(realtimePCR，qPCR)技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品更是將PCR由體外合成及定性/半定量檢測技術(shù)發(fā)展成為一種高靈敏、高特異性和精確定量的基因分析技術(shù)。盡管經(jīng)過十幾年時間的迅速發(fā)展，qPCR 技術(shù)已經(jīng)用于除外傷和營養(yǎng)缺乏癥外所有疾病的診斷，但是，在 PCR擴增過程中影響其擴增效率的因素有很多，不能保證在反應(yīng)過程中擴增效率保持不變和實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品以及不同樣品之間的擴增效率是相同的，由此導(dǎo)致其定量分析所依賴的基礎(chǔ)——循環(huán)閾值(CT)不是恒定不變的。因此 qPCR 的定量只是“相對定量”，其準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學(xué)定量分析的要求。整個實驗過程需嚴格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進行實驗操作。
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR技術(shù)具有極高的靈敏度、特異性和精確性，但截止目前而言，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài)，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次。數(shù)字PCR被稱為第三代PCR技術(shù)，相比于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)，其具有諸多優(yōu)勢：（1）***定量，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和參考曲線，定量結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠；（2）高靈敏度，可實現(xiàn)單分子級檢測；（3）高分辨率，適合在大量背景模板的干擾下對罕見的目標(biāo)分子進行檢測；（4）高穩(wěn)定性，對抑制劑的耐受程度**增強。憑借這些優(yōu)勢，數(shù)字PCR被廣泛應(yīng)用于多個不同的領(lǐng)域[4]，特別是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括稀有突變檢測、基因拷貝數(shù)變異檢測、基因表達研究、甲基化水平檢測、**液體活檢、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測、微生物（病毒、細菌等）檢測、移植排斥監(jiān)控和二代測序輔助建庫等。此外，此技術(shù)也被用于農(nóng)業(yè)、食品安全和環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域。市場想象空間大，國內(nèi)外入局者眾多。重現(xiàn)性數(shù)字PCR歡迎咨詢
基因豐度非常低的，或者樣本濃度低的，可以選擇數(shù)字化PCR。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作
（5）在SARS-CoV-2核酸參考品制備中，數(shù)字PCR能夠?qū)怂徇M行精確的定量，能夠提高世界各國SARS-CoV-2核酸測量結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性。（6）數(shù)字PCR能夠靈敏檢測與定量環(huán)境中的病毒RNA濃度，包括從不同環(huán)境中取樣的樣本（如公共區(qū)域、病房、醫(yī)院衛(wèi)生間、實驗室操作員手套、廢水等等）。（7）在實驗室樣品與臨床樣品病毒突變檢測中，數(shù)字PCR適合用于已知的SARS-CoV-2遺傳變異檢測，特別是對于一些低頻突變。（8）在抗病毒藥物的研發(fā)過程中，病毒載量的變化是評估藥物有效性的重要指標(biāo)，借由數(shù)字PCR提供的***定量結(jié)果，能夠給出更具說服力和準(zhǔn)確的評價結(jié)果。山東重現(xiàn)性數(shù)字PCR共同合作