泛凋亡！TRIM56調(diào)節(jié)YBX1泛素化降解

脊髓損傷(SCI)是中SHU神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，治LIAO 極具挑戰(zhàn)。促炎性細(xì)胞死亡影響神經(jīng)炎癥和損傷預(yù)后。PANoptosis是新發(fā)現(xiàn)的促炎性細(xì)胞死亡類(lèi)型，通過(guò)PANoptosome調(diào)節(jié)多種細(xì)胞死亡執(zhí)行分子JI活，為SCI治LIAO 提供新靶點(diǎn)，但其具體作用和機(jī)制尚待闡明。

2024年9月，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院***附屬醫(yī)院團(tuán)隊(duì)在Advanced Science（IF=14.3）上，發(fā)表“TRIM56 Modulates YBX1 Degradation to Ameliorate ZBP1-Mediated Neuronal PANoptosis in Spinal Cord Injury”的研究成果。揭示了YBX1在SCI發(fā)病機(jī)理中調(diào)節(jié)ZBP1介導(dǎo)的PANoptosis的新功能，為SCI的治LIAO 策略提供了新的見(jiàn)解。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）SCI后神經(jīng)元中的YBX1表達(dá)明顯增加。

2）YBX1通過(guò)ZBP1介導(dǎo)PANoptosis，促進(jìn)脊髓損傷。

3）機(jī)制上，TRIM56與YBX1結(jié)合，促進(jìn)其泛素化，從而加速其降解，導(dǎo)致YBX1穩(wěn)定Zbp1 mRNA能力下降，ZBP1的表達(dá)減少，進(jìn)一步減弱ZBP1介導(dǎo)的PANoptosis，抑制脊髓損傷。

表達(dá)相關(guān)性：

SCI后神經(jīng)元中的YBX1表達(dá)明顯增加。

功能研究：

YBX1敲除抑制神經(jīng)元的PANoptosis，促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

機(jī)制研究：

（1）YBX1通過(guò)調(diào)節(jié)Zbp1的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)脊髓損傷后神經(jīng)元的PANoptosis

YBX1是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)RBP，因此YBX1可能通過(guò)影響相關(guān)RNA影響脊髓損傷小鼠的預(yù)后。RIP-seq實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YBX1-RIP組中Zbp1的富集程度高于IgG組（圖1a）。RIP-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這一結(jié)果（圖1b）。而WB和qPCR實(shí)驗(yàn)表明，Zbp1 mRNA的豐度和ZBP1的蛋白表達(dá)與YBX1表達(dá)的變化相關(guān)（圖1c-e）。結(jié)果表明，YBX1通過(guò)增加Zbp1的穩(wěn)定性來(lái)促進(jìn)ZBP1的蛋白表達(dá)。

后續(xù)的功能研究結(jié)果顯示，ZBP1敲除可有效抑制YBX1過(guò)表達(dá)引起的Cle-CASP1、GSDMD-N、Cle-CASP3、p-RIPK3和p-MLKL水平升高，及IL-18和IL-1β水平升高（圖1f-i）。表明ZBP1介導(dǎo)的PANoptosis在SCI后神經(jīng)元中發(fā)生，并受YBX1調(diào)節(jié)。

圖1 YBX1通過(guò)調(diào)節(jié)Zbp1的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)脊髓損傷后神經(jīng)元的PANoptosis（Ref. Fig 3/S4-7）

（2）TRIM56 與 YBX1 相互作用

第一步，確定調(diào)節(jié)YBX1表達(dá)的潛在機(jī)制---泛素-蛋白酶體降解途徑

為了進(jìn)一步確定調(diào)節(jié)YBX1表達(dá)的潛在機(jī)制，泛素-蛋白酶體降解途徑和自噬-溶酶體途徑是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的兩種重要途徑。用MG132、3MA和CQ處理原代神經(jīng)元（3MA是一種普遍使用的抑制細(xì)胞自噬的抑制劑，可抑制III類(lèi)PI3K；CQ通過(guò)增加酸性?xún)?nèi)體/溶酶體的pH值來(lái)破壞溶酶體功能；MG132是一種普遍使用的泛素-蛋白酶體降解途徑抑制劑。），發(fā)現(xiàn)MG132處理后，YBX1的表達(dá)水平升高（圖2a）。表明泛素-蛋白酶體降解途徑可能是YBX1在神經(jīng)元中的主要調(diào)節(jié)機(jī)制。

第二步，確定TRIM56與YBX1相互作用

IP-MS和分子對(duì)接分析顯示，E3泛素連接酶TRIM56與YBX1強(qiáng)結(jié)合（圖2b-e）。細(xì)胞水平內(nèi)源性、外源性Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRIM56與YBX1相互作用（圖2f-h）。另外，Co-IP實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，在SCI模型小鼠和OGD處理過(guò)的神經(jīng)元中，TRIM56的表達(dá)及其與YBX1的結(jié)合均減少（圖2i-j）。表明TRIM56與YBX1之間存在相互作用。

第三步，確定TRIM56與YBX1相互作用的結(jié)合區(qū)域

構(gòu)建一系列截短的Myc標(biāo)簽YBX1載體，進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，以確定YBX1 TRIM56特異性結(jié)合的區(qū)域。Co-IP結(jié)果顯示，TRIM56只與YBX1的M3(Δ126-324)片段結(jié)合（圖2k-l）。表明TRIM56與YBX1之間存在直接相互作用。

圖2 TRIM56與YBX1 相互作用（Ref. Fig 4/S9）

（3）TRIM56促進(jìn)YBX1的泛素化和降解

第一步，TRIM56促進(jìn)YBX1降解

為了明確調(diào)節(jié)TRIM56是否會(huì)影響YBX1的泛素化和降解。發(fā)現(xiàn)添加MG132可以消除TRIM56過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致的YBX1表達(dá)下降，而該處理對(duì)Ybx1 mRNA水平?jīng)]有影響（圖3a-b）。CHX用于抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，在該條件下，發(fā)現(xiàn)TRIM56的過(guò)表達(dá)明顯縮短YBX1的半衰期，而沉默TRIM56則明顯延長(zhǎng)YBX1的半衰期（圖3c-f）。

第二步，TRIM56促進(jìn)YBX1的泛素化降解

Co-IP分析顯示，TRIM56過(guò)表達(dá)后，YBX1的泛素化水平明顯增加，而YBX1的表達(dá)則明顯降低（圖3g-h）。分別構(gòu)建TRIM56 WT、突變體，進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TRIM56的過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)YBX1的泛素化和降解，但C21/24A突變體TRIM56沒(méi)有這種效果（圖3i-k）。此外，當(dāng)過(guò)表達(dá)C21/24A突變體時(shí)，不會(huì)發(fā)生因TRIM56過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的YBX1半衰期縮短（圖3l）。結(jié)果表明TRIM56直接泛素化YBX1，以促進(jìn)其蛋白酶體降解。

圖3 TRIM56促進(jìn)YBX1的泛素化和降解（Ref. Fig 5）

結(jié)論：該研究利用蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)SCI后神經(jīng)元中的YBX1表達(dá)明顯增加。功能上，YBX1敲除促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。機(jī)制上，TRIM56與YBX1結(jié)合并促進(jìn)其泛素化，從而加速其降解，導(dǎo)致YBX1保護(hù)Zbp1 mRNA穩(wěn)定性降低、表達(dá)下降，從而抑制ZBP1介導(dǎo)的PANoptosis，進(jìn)而抑制脊髓損傷。為SCI的治LIAO 策略提供了新的見(jiàn)解。