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在96孔板上用光片熒光顯微鏡對(duì)多細(xì)胞球體中葡萄糖生物傳感器的
光片熒光顯微鏡先前已經(jīng)在市售的倒置熒光顯顯微鏡架上使用斜面顯微鏡(OPM)的方法進(jìn)行了演示。在本文中，OPM被調(diào)整為允許使用階段掃描OPM方法(SSOPM)在市售的96孔玻璃底板中的3-D生物培養(yǎng)物的延時(shí)3-D成像。延時(shí)3-D成像的多細(xì)胞球體表達(dá)葡萄糖Frster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)生物傳感器在16個(gè)視場，圖像采集的時(shí)間間隔為10分鐘。作為原理驗(yàn)證，SSOPM 系統(tǒng)還用于獲得劑量響應(yīng)曲線，在96孔板的42個(gè)孔中，培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度變化，整個(gè)獲取時(shí)間為9分鐘。3-D圖像數(shù)據(jù)使FRET比作為從球體表面的距離的函數(shù)來測量?？偟膩碚f，結(jié)果證明了OPM系統(tǒng)在多孔板格式下測量多細(xì)胞球體中FRET比隨時(shí)間變化的三維時(shí)空變化的能力。
兩個(gè)SCMOS相機(jī)（德國Excelitas PCO 公司pco.edge高速相機(jī)）均配置為在全局重置采集模式下采集1280x1000像素。曝光時(shí)間由2 ms激光照射周期確定。為了獲得一個(gè)視場，x-y平臺(tái)被配置為沿y方向掃描500微米。在3個(gè)信道(供體、感光發(fā)射、直接激發(fā)受體)中的每個(gè)信道中產(chǎn)生250個(gè)圖像的疊加。總體而言，在采集過程中，相機(jī)1以100 Hz觸發(fā)，相機(jī)2以50Hz觸發(fā)。每個(gè)3-D卷花了5秒來獲取和產(chǎn)生2 GB的原始圖像數(shù)據(jù)。
圖像采集由一臺(tái)便攜式高速儲(chǔ)存系統(tǒng)控制，這臺(tái)PC具有96G的RAM，配置2x512MBSSD硬盤和配置在RAID6中的8x2TB硬盤。
用457 nm激光激勵(lì)時(shí)，每個(gè)攝像機(jī)的平均背景水平通過取空白視場中的平均像素值來確定我們稱之為攝像機(jī)1的IDA背景和攝像機(jī)2的IpD背景。
倒置顯微鏡框架配有溫度控制外殼，溫度設(shè)定為37℃。顯微鏡目標(biāo)物01裝有供連續(xù)供應(yīng)水浸液的套圈，加熱套圈設(shè)置為保持37°C(0280.36，Pecon)。
證明了在市售玻璃底96孔板中表達(dá)FRET生物傳感器的MC中探測3D時(shí)空動(dòng)態(tài)的潛我們使用表達(dá)細(xì)胞間葡萄糖雙功能的細(xì)胞，使用細(xì)胞測量法進(jìn)力。行測量。亞細(xì)胞分辨率成像獲得成像深度~100um的球體。我們以10分鐘的間隔對(duì)16口井成像4小時(shí)，生成530GB的原始圖像數(shù)據(jù)(板1)。在制備和成像于不同日期的板上重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，說明了該方法的可重復(fù)性(板2)。我們展示了SSOPM 在96個(gè)孔板中進(jìn)行葡萄糖劑量-反應(yīng)三維測需要9分鐘的圖像采集(板3)。量的潛力，使用42個(gè)孔板。
我們的 3D 成像方法顯示，在葡萄糖存在下培養(yǎng)的球體中心的 FRET比值增加。這可能是由于球體內(nèi)葡萄糖或 pH的梯度，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和/或使用改進(jìn)的牛物傳感器來進(jìn)一步調(diào)查。此外，我們使用 SSOPM 記錄了葡萄糖缺乏的 HEK293T球體暴露于葡萄糖時(shí)的時(shí)空 FRET比值響應(yīng)。使用獲得的 3D 圖像數(shù)據(jù)，我們計(jì)算出 FRET比值作為圖像點(diǎn)與球體表面**小距離隨時(shí)間的變化函數(shù)。在未來，SSOPM可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多應(yīng)用于研究各種各樣的FRET生物傳感器。
德國Excelitas PCO公司pco.egde高速相機(jī)，具備高分辨率、高感光度、雙幀PIV瞬間成像的優(yōu)點(diǎn)，將高速實(shí)驗(yàn)過程完美記錄，為實(shí)驗(yàn)提供強(qiáng)而有力的圖像數(shù)據(jù)支持。
廣州市元奧儀器有限公司作為德國Excelitas PCO公司高速攝像機(jī)在中國的代理商，為客戶提供各種高速成像系統(tǒng)解決方案，如對(duì)相關(guān)產(chǎn)品感到興趣，歡迎隨時(shí)聯(lián)系交流。
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