江西GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

抗體 Fc 糖基化譜是一種重要的 CQA，因?yàn)樗鼤?huì)影響療效、和免疫原性。因此，需要從早期開(kāi)發(fā)、工藝開(kāi)發(fā)到質(zhì)量控制和批量放行的整個(gè)過(guò)程對(duì)Fc聚糖譜進(jìn)行監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的分析方法基于對(duì)游離的聚糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后通過(guò)HILIC-HPLC或CE進(jìn)行分析，這需要多步驟的樣品制備方案，這需要大量的時(shí)間和資源。使用Genovis的FabRICATOR MagIC酶解mAb，然后使用LC-MS進(jìn)行中級(jí)分析，為Fc聚糖分析提供了一種快速、直接的替代方法。如上所示，它很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以提高通量并降低處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。Genovis的FabRICATOR MagIC酶解mAb，使用LC-MS進(jìn)行中級(jí)分析。江西GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

其他基于 IgG 的生物制藥需要仔細(xì)表征和監(jiān)測(cè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，例如氧化、糖基化和其他翻譯后修飾。與抗體的克隆選擇、工藝開(kāi)發(fā)和穩(wěn)定性研究相關(guān)的大量樣品通常通過(guò)液相色譜質(zhì)譜 （LC-MS） 進(jìn)行分析。然而，在LC-MS之前進(jìn)行足夠規(guī)模的樣品制備通常具有挑戰(zhàn)性。為了解決樣品制備的挑戰(zhàn)，Genovis將半胱氨酸蛋白酶FabRICATOR（IdeS）固定在磁性瓊脂糖珠上，現(xiàn)在稱為FabRICATOR MagIC。FabRICATOR固定在磁珠上，可同時(shí)快速自動(dòng)消化多種抗體，促進(jìn)中級(jí)表征工作流程。Genovis的FabRICATOR MagIC 如何以較少的用戶交互減少實(shí)驗(yàn)和操作時(shí)間，降低樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)提高通量。四川FabDELLOIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)IgASAP酶是降低zhiliao性IgA候選物樣品復(fù)雜性并明顯簡(jiǎn)化IgA分析表征的寶貴工具。

與IdeS不同，Genovis的GingisREX（RgpB）是一種精氨酸特異性蛋白酶，可消化精氨酸殘基的C末端蛋白質(zhì)，包括難以與其他酶消化的Arg-Pro鍵。該酶可用于肽圖分析、從頭肽測(cè)序和翻譯后修飾分析。精氨酸殘基的特異性C-末端消化；在其他困難的精氨酸-脯氨酸序列中可靠消化；產(chǎn)生更長(zhǎng)的肽-提高序列覆蓋率。GingisREX是一種半胱氨酸蛋白酶，可特異性地消化肽鍵C末端到精氨酸殘基，包括與脯氨酸相連的精氨酸。半胱氨酸是酶活性所必需的。與胰蛋白酶消化相比，可生成更長(zhǎng)的肽，胰蛋白酶消化可以通過(guò)高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行分離和鑒定。這為自下而上方法的樣品制備提供了更多選擇，以實(shí)現(xiàn)替代的酶解曲線和更高的序列覆蓋率。GingisREX在賴氨酸上沒(méi)有活性，通常使用Arg-C觀察到。該酶在5.0-9.0的寬pH值范圍內(nèi)具有活性，它需要半胱氨酸并被鹽酸胍抑制。該酶是從牙齦卟啉單胞菌中純化的。

與IdeS不同，Romiplostim 由四個(gè)相同的血小板生成素 （TPO） 受體結(jié)合肽和一個(gè) Fc 片段組成，通過(guò)柔性聚甘氨酸序列連接在一起。與度拉糖肽類似，用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 在 37°C 下過(guò)夜，或用 GlySERIAS 凍干 1 小時(shí)并在 37°C 下過(guò)夜消化該蛋白質(zhì)。 鏈間二硫鍵被還原，以便于通過(guò)反相LC-MS進(jìn)行以下分析。與度拉糖肽的觀察結(jié)果類似，用固定化酶消化產(chǎn)生均質(zhì)的 Fc/2，剩下一個(gè)連接子殘基，此處為甘氨酸殘基。這有助于識(shí)別專門位于Fc區(qū)域的修改。用凍干酶消化 1 小時(shí)得到 Fc/2，剩余 4 個(gè)甘氨酸殘基和少量的 Fc/2 仍與一個(gè) TPO 肽連接。另一方面，這使得研究 Fc/2 和第yi個(gè)肽之間的連接區(qū)域成為可能，而不會(huì)受到第二個(gè)肽的干擾。用 GlySERIAS 凍干液過(guò)夜消化產(chǎn)生 2 個(gè) Fc/2 變體，分別剩下 4 個(gè)和 1 個(gè)甘氨酸殘基。根據(jù)消化時(shí)間的不同，使用凍干產(chǎn)物釋放的肽以五或七種變體存在，接頭中殘留的甘氨酸殘基數(shù)量不同，而使用固定化產(chǎn)物釋放的肽以四種變體存在。為了降低度拉糖肽復(fù)雜性，使用GlycINATOR Lyophilized去除Fc聚糖，并用DTT還原鏈間二硫鍵。

IgA 消化酶的 IgASAP 家族特異性消化血清和分泌型人 IgA 以生成 Fab 和 Fc 片段。IgASAP Sub1 特異性消化人 IgA1，而 IgASAP Sub1+2 同時(shí)消化人 IgA1 和 IgA2m1。 Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質(zhì)的 Fab 和 Fc 片段。為了獲得純和完整的Fab片段，使用Genovis的GingisKHAN Fab Kit進(jìn)行人IgG1的消化和抗體片段的后續(xù)純化。通過(guò)與 GingisKHAN 孵育，然后在 CaptureSelect? 人 CH1 離心柱上親和純化，在曲妥珠單抗上證明了完整的片段生成。樣品的酶和Fc部分存在于色譜柱的流通中，F(xiàn)ab很容易通過(guò)降低pH洗脫。使用該試劑盒，可以制備 0.5 mg 至 2 mg 人 IgG1 的 Fab 片段。Genovis同時(shí)提供IdeS酶的純化試劑盒。為了分別研究度拉糖肽的肽和 Fc 區(qū)域，用GlySERIAS 在 37°C 下凍干消化1 小時(shí)。江西GlySERIASIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

Genovis 酶產(chǎn)品，被世界各地的科學(xué)家使用，創(chuàng)新的產(chǎn)品形式促進(jìn)了生物藥物的開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制。江西GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

與肽圖譜相比，根據(jù)Genovis科學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)，尤其是對(duì)于像抗體這樣的分子，許多人在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中做了太多的肽圖譜，而中級(jí)水平（Middle-level）的方法可以很好地工作。中級(jí)方法（IdeS酶切抗體）需要更少的實(shí)際操作步驟和較少的示例處理，所有這些都意味著過(guò)程中出錯(cuò)的事情更少。我們的許多酶可以作為平臺(tái)方法，同樣的方法適用于絕大多數(shù)的抗體，這不是肽圖的情況下，可能需要優(yōu)化整個(gè)樣品制備，LC分離，質(zhì)譜設(shè)置和數(shù)據(jù)分析的每個(gè)不同的抗體分析。這些變化可能是很小的，但沒(méi)有一種適用于所有肽圖的方法。由于分析和數(shù)據(jù)分析的簡(jiǎn)單性，中級(jí)方法非常適合自動(dòng)化和高通量的工作流程。肽圖當(dāng)然可以自動(dòng)用于樣品制備，但高通量肽圖生成大量數(shù)據(jù)，仍然需要徹底分析。事實(shí)上，肽圖譜是一個(gè)多步驟的過(guò)程，每一個(gè)步驟都可能破壞方法，并可能導(dǎo)致破壞蛋白質(zhì)的人工制品，很難交叉訓(xùn)練給非專業(yè)人員。中級(jí)水平的方法很容易交叉訓(xùn)練，我們的方法在質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室中被成功地使用。肽圖譜是一種用于修飾分析和氨基酸確認(rèn)的方法，但一旦完成了這一工作，我相信使用中級(jí)分析可以成功地更有效地完成抗體樣本的大部分工作。江西GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)