吉林FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

與IdeS不同，為了獲得更均勻的度拉糖肽融合蛋白的消化產(chǎn)物，用Genovis的GlySERIAS固定化蛋白質(zhì)消化該蛋白質(zhì)，該蛋白由與瓊脂糖珠共價偶聯(lián)的GlySERIAS酶組成。通過將酶偶聯(lián)到樹脂上，可以增加酶與蛋白質(zhì)的比率，從而可以進(jìn)一步加速反應(yīng)，以獲得更完整的連接子消化。此外，該酶不會存在于樣品制備中，可能會干擾樣品分析。為了進(jìn)行比較，度拉糖肽在37°C下用GlySERIAS固定化過夜，或用GlySERIAS凍干1小時并在37°C下過夜消化。 為了降低樣品復(fù)雜性，使用內(nèi)切糖苷酶GlycINATOR凍干去除Fc聚糖，并減少鏈間二硫鍵。通過反相LC-MS對樣品的分析表明，GlySERIAS Immobilized幾乎完全消化了Fc結(jié)構(gòu)域中的連接子，留下了接近均質(zhì)的Fc/2產(chǎn)物，其中含有來自連接子的一個絲氨酸殘基。用 GlySERIAS 凍干 1 小時或過夜消化，兩者都會產(chǎn)生幾種 Fc 產(chǎn)物，并附著不同數(shù)量的絲氨酸和甘氨酸殘基。GLP-1肽在所有三個樣品中以兩種變體存在。使用GlySERIAS固定化消化的均質(zhì)Fc/2能夠詳細(xì)研究特定于Fc區(qū)域的質(zhì)量屬性。此外，在樣品中未觀察到干擾分析的酶峰。作為補充，F(xiàn)c/2 產(chǎn)物在用 GlySERIAS 凍干消化后殘留部分連接子，有助于研究位于 GS 連接子的修飾。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等傳統(tǒng)酶可用于生成 Fab 片段，但非特異性酶活性需要仔細(xì)優(yōu)化，降低多個消化位點的風(fēng)險。吉林FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

與IdeS不同。Genovis的IgASAPSub1是一種IgA1特異性酶，可在鉸鏈上方的一個特定位點消化人IgA1，產(chǎn)生完整且均質(zhì)的Fab和Fc片段。IgASAPSub1可水解分泌物和血清IgA1。消化在1小時內(nèi)完成，并且由于酶的特異性，如果孵育時間延長，則不存在過度消化的風(fēng)險。該酶在pH值6.5至8.0下具有活性，不需要還原條件或輔助因子即可發(fā)揮活性?；钚允窃?7°C下，但也可以在室溫下使用增加孵育時間進(jìn)行消化。IgASAPSub1是從口腔鏈球菌克隆而來的，并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有His標(biāo)簽，分子量為148kDa。IgASAPSub1凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在1000個單位的小瓶中，用于消化1mgIgA1。安徽FabALACTICAIdeS蛋白酶使用GlySERIAS固定化消化融合蛋白得到均質(zhì)Fc/2。

大多數(shù)zhiliao性抗體都攜帶人IgG1骨架，雙特異性和多特異性形式的開發(fā)正在迅速增加。此類抗體的分析需要特異性酶來表征特性，例如單價結(jié)合、二硫鍵擾亂和配對Fc糖基化。傳統(tǒng)方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化，這需要優(yōu)化以極大限度地減少過度消化并獲得足夠的產(chǎn)量。Genovis的FabDELLO與IdeS酶具有不同的特異性，它在鉸鏈上方的單個位點消化人IgG1，并產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。為了證明FabDELLO的特異性活性，通過非還原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的選擇。所有底物均實現(xiàn)了完全消化，包括具有其他困難的LALA和LFLE突變的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精確和有效性能驗證了其在生物制藥開發(fā)中的用途。

Genovis酶的適應(yīng)性和更高的通量和自動化工作流程的中級方法，這是非常重要的。 隨著分析方法和儀器的改進(jìn)，在表征實驗室中有更大的能力進(jìn)行更多類型的分析，或者在工藝開發(fā)或QC實驗室中有更先進(jìn)的分析儀器。 當(dāng)涉及到能夠支持大量樣本分析的活動時，例如克隆篩選，工藝開發(fā)和驗證以及穩(wěn)定性研究，這是非常好的。 此外，Genovis產(chǎn)品的效率、健壯性（Robust）和易用性使它們更容易應(yīng)用于這些類型的工作，而且，也適用于受控環(huán)境中的批次放行方法。Genovis的產(chǎn)品很好地支持這種類型的工作，這也促使Genovis不斷推出新產(chǎn)品和現(xiàn)有產(chǎn)品的不同形式，以支持客戶的工作。含有富含甘氨酸的連接子的各種mAb片段進(jìn)行詳細(xì)表征的中級方法。

Genovis的FabRICATOR MagIC自動樣品制備可用于分析和監(jiān)測不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲存過程中的氧化就是這樣一種CQA，可能會影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個問題，對6種mAb的混合物進(jìn)行強制降解（室溫下3個月），并通過反相LC-MS進(jìn)行分析。當(dāng)在完整水平上分析mAb時，可以檢測到mAb5豐度的顯著差異，同時出現(xiàn)許多新的峰。然而，無法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC，mAb5變化的來源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段，可以識別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化，通過形成氧代內(nèi)酯 （+14 Da） 和二氧代內(nèi)酯 （+30 Da） 以及 mAb5 LC （-18 Da） 的琥珀酰亞胺化來揭示。此外，還可檢測到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說明了FabRICATOR MagIC在mAb中級分析中的強大功能，它創(chuàng)建的片段足夠小，可以精確定位特定的修飾，而無需耗時耗費資源的肽圖分析，所有這些都以相對較少的手動操作時間快速完成。Genovis的策略是幫助客戶進(jìn)行亞基分析，特別是我們的蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)品，如IdeS蛋白酶。遼寧FabDELLOIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

使用 Genovis的GlySERIAS Immobilized 對包含多個柔性連接子蛋白進(jìn)行質(zhì)量控制的中級分析方法具有強大的功能。吉林FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶

大多數(shù)商業(yè)zhiliao性抗體屬于IgG類，在Fc結(jié)構(gòu)域中含有N-聚糖。一個重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性是糖基化曲線，因為它會影響穩(wěn)定性、溶解度、藥效學(xué)和藥代動力學(xué)特性。這種翻譯后修飾可能發(fā)生在生物工藝開發(fā)和制造過程中，因此需要密切監(jiān)測。Genovis的FabRICATOR（IdeS）酶已成為一種被接受的快速表征單克隆抗體（mAb）的分析工具。FabRICATOR在鉸鏈下方消化IgG，產(chǎn)生F（ab'）2和Fc/2片段。單個FabRICATOR消解位點和質(zhì)量譜的后續(xù)精度使Fc糖基化譜能夠檢測，從而可以監(jiān)測批次間的一致性和其他關(guān)鍵質(zhì)量屬性。吉林FabALACTICAIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶