四川用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)

我們展示了使用兩種蛋白作為底物的OmniGLYZOR的性能。依那西普是一種 Fc 融合蛋白，含有 TNFα 受體的胞外結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域用 2 個(gè) N-糖和 8-11 個(gè) 1 個(gè)具有不同程度唾液酸化的 O-聚糖修飾。在 37°C 下將這種重糖基化蛋白在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小時(shí)，可完全去除所有 N-和 O-糖，如中級(jí) LC-MS 分析所示。促紅xibao生成素 （EPO） 是一種攜帶 3 個(gè) N-聚糖和 1 個(gè)he心 1 個(gè) O-聚糖的小蛋白質(zhì)，其總質(zhì)量的近 40% 由聚糖組成。O-連接聚糖通常存在于蛋白質(zhì)的暴露位置，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘鞍踪|(zhì)折疊發(fā)生后附著。只有負(fù)責(zé)其合成的糖基轉(zhuǎn)移酶才能接觸到這些暴露的位點(diǎn)。應(yīng)用：降低樣品復(fù)雜性、電荷異構(gòu)體分析和外切糖苷酶陣列。四川用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)

在這里，Genovis分析了 C1 抑制劑——一種人血漿衍生的生物zhiliao藥物，由 6 種 N-聚糖和多達(dá) 28 種 O-聚糖修飾，主要由唾液酸he心 1 結(jié)構(gòu)組成。在不對(duì)這種高度異質(zhì)的蛋白質(zhì)進(jìn)行任何預(yù)處理的情況下，反相LC-MS分析產(chǎn)生了無法詳細(xì)解釋的復(fù)雜質(zhì)譜圖。在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時(shí)內(nèi)有效去除所有O-聚糖。然而，蛋白質(zhì)上仍殘留著 1 到 3 個(gè) N-聚糖。使用凍干的PNGase F和OmniGLYZOR試劑盒中包含的MS友好型RapiGest? SF表面活性劑*，在變性條件下通過額外的去糖基化步驟去除這些不可接近的N-聚糖。觀察到所有聚糖的完全去除，但分子上存在的少量he心 2 O-聚糖除外。水解O-聚糖的酶不會(huì)從變性中獲益，這就是為什么OmniGLYZOR Microspin色譜柱只能在非變性條件下使用的原因。北京PNGaseF去糖基化酶OmniGLYZOR Microspin 小柱中包含以下組分：PNGase?F；O-糖苷酶。

為了研究 OglyZOR 對(duì)天然糖蛋白的活性，將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時(shí)。當(dāng)唾液酸被去除時(shí)，OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品，以鑒定其他PTM或確認(rèn)氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化：O-糖基化生物制藥（如依那西普）很難表征。為了能夠通過質(zhì)譜法測(cè)定完整質(zhì)量數(shù)，我們進(jìn)行了酶促總?cè)ヌ腔?。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解，而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。

SialEXO 2-3 在天然條件下水解糖蛋白，在 pH 值范圍為 7.0 至 9.0 時(shí)顯示出活性。該酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。該酶具有 His 標(biāo)簽，分子量為 66 kDa。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高用于離心柱中糖蛋白去唾液酸化的固定化酶。Genovis的SialEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)的SialEXO酶，用于糖蛋白的去唾液酸化，而不會(huì)被酶污染z終制劑。它水解天然糖蛋白上的唾液酸（α2-3、α2-6 和 α2-8）并釋放出聚糖。效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。對(duì)天然糖蛋白或游離的聚糖結(jié)構(gòu)上存在的 N- 和 O-連接聚糖均具有活性。

Genovis的PNGase F（肽 N-糖苷酶 F）是一種糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺與所有哺乳動(dòng)物天冬酰胺連接復(fù)合物、雜交或高甘露糖寡糖的內(nèi)層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。該酶用于MS分析前的樣品制備，以降低蛋白質(zhì)異質(zhì)性并實(shí)現(xiàn)游離的聚糖分析，并研究N-聚糖的功能作用。1. 對(duì)所有哺乳動(dòng)物N-聚糖的高效水解；2.對(duì)多種糖蛋白具有活性；3.可固定在即用型離心柱產(chǎn)品形式；4. 自動(dòng)化友好型，96孔板，用于高通量 N-糖去除。Genovis的ImpaRATOR 是一種 O-糖依賴性蛋白酶，可消化攜帶粘蛋白型。O-聚糖的蛋白質(zhì)，包括唾液酸化物質(zhì)、糖基化絲氨酸和 Thr 殘基的 N-末端。該酶產(chǎn)生攜帶 O-糖的糖肽，從而實(shí)現(xiàn) O-糖譜分析、位點(diǎn)占用測(cè)定和 O-糖肽圖譜以及使用 LC-MS 分析的中級(jí)方法。1. 特異性廣 - 接受多種 O-聚糖變體，包括唾液酸化物種；2. 可靠O-聚糖特異性蛋白酶 – 消化絲氨酸/蘇氨酸糖基化位點(diǎn)的 N 末端；3. 穩(wěn)健的消化，增強(qiáng)復(fù)雜生物制藥的表征。SialEXO是用于去除和分析唾液酸的唾液酸酶；吉林凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

Genvois展示了使用兩種zhiliao蛋白作為底物的OmniGLYZOR的性能：依那西普和促紅xibao生成素 （EPO）。四川用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)

與PNGase F類似，Genvois的OmniGLYZOR用于攜帶N-和簡(jiǎn)單O-糖的糖蛋白的去糖基化。 OmniGLYZOR 試劑盒包括：OmniGlyZOR 微離心柱；PNGase F 凍干；RapiGest?* SF表面活性劑。除非底物蛋白變性，否則某些 N-糖基化位點(diǎn)很難或無法被 PNGase F 接近。在OmniGLYZOR Microspin柱上孵育后剩余的N-糖可以在變性條件下使用試劑盒中包含的PNGase F凍干和RapiGest? SF表面活性劑通過額外的去糖基化步驟去除。使用Genovis的OpeRAT對(duì)EPO進(jìn)行O-糖位點(diǎn)特異性消化：對(duì)于jin攜帶一個(gè)或幾個(gè) O-糖基化位點(diǎn)的簡(jiǎn)單底物蛋白，OpeRATOR 也可用于繪制中間水平的 O-糖基化位點(diǎn)。 四川用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)