甘肅高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

G0F 抗體在 30 分鐘內(nèi)：半乳糖的存在會(huì)影響zhiliao性抗體引發(fā)的效應(yīng)功能，為了研究抗體的作用方式，可能需要徹底去除半乳糖殘留物。Genovis的GalactEXO Immobilized 的 β1-4 半乳糖苷酶活性在曲妥珠單抗上使用 30 分鐘孵育證明。genovis的GalactEXO Immobilized 由強(qiáng)大的 GalactEXO 酶組成，該酶固定在瓊脂糖珠上，并以易于使用的微離心柱形式格式化。GalactEXO是β-半乳糖苷酶的混合物，可有效去除N-和O-糖基化蛋白上的半乳糖殘基。使用FabRICATOR?將抗體消化成亞基，并使用LC-MS進(jìn)行分析。使用 GalactEXO 凍干和 GalactEXO 固定化都可以看到向 G0F 糖型的轉(zhuǎn)變，但后者在z終制劑中沒(méi)有留下酶。沒(méi)有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解，因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。沒(méi)有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解，因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。GalactEXO 是一種β-半乳糖苷酶混合物，可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-連接末端半乳糖。甘肅高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

C1抑制劑的去糖基化：在O-糖基化生物制藥的生產(chǎn)過(guò)程中，由于he心GalNAc殘基的加工不完全，可能會(huì)出現(xiàn)Tn抗原。這表現(xiàn)為具有 203 Da HexNAc 單位差異的重復(fù)質(zhì)量位移。為了確認(rèn) Tn 抗原的存在，可以應(yīng)用以下工作流程，此處在重度（26 個(gè)位點(diǎn)）O-糖基化 C1 抑制劑上演示。首先，使用PNGaseF修剪糖蛋白的N-糖，使用Genovis的OglyZOR和SialEXO修剪he心1 O-糖。依那西普的磷性能測(cè)試?：依那西普是另一種具有挑戰(zhàn)性的生物制藥模型分子，攜帶 13 個(gè) O-聚糖位點(diǎn)，其中平均 9 至 10 個(gè)位點(diǎn)被占用。N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究GalNAcEXO凍干劑以凍干粉末的形式提供，裝在2000單位的小瓶中，用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc殘基。

Genovis的ImpaRATOR? 和 OpeRATOR? - 兩種協(xié)同的作用：O-糖蛋白酶。使用ImpaRATOR或OpeRATOR消化后分析依那西普重糖基化區(qū)域O-聚糖位點(diǎn)的覆蓋率（圖3）。使用OpeRATOR鑒定對(duì)應(yīng)于所有13個(gè)O-聚糖位點(diǎn)的肽，而使用ImpaRATOR只能明確鑒定10個(gè)位點(diǎn)。ImpaRATOR 可能比 OpeRATOR （1） 具有更具選擇性的氨基酸序列偏好，此處由 S186 和 T245 位點(diǎn)缺乏消化來(lái)表明。此外，ImpaRATOR 在兩個(gè)相鄰的 O-糖基化氨基酸之間顯示出有限的裂解，如 S213 位點(diǎn)酶解肽的缺乏以及 T200 和 T217 位點(diǎn)酶解肽的低強(qiáng)度所證明的那樣。在OpeRATOR酶解樣品（T184-S199和T200-H204;圖2b和d），而在ImpaRATOR消化的樣品中，具有漏裂的相應(yīng)肽（S184-H204）的強(qiáng)度更高。 雖然OpeRATOR顯示出更高的O-聚糖位點(diǎn)覆蓋率，但使用ImpaRATOR進(jìn)行消化可以表征O-聚糖結(jié)構(gòu)，包括唾液酸化物種。例如，條形圖插入顯示了兩種糖肽 T184-V198 和 T205-P207 的 O-聚糖種類。這應(yīng)該與使用OpeRATOR的消化進(jìn)行比較，在OpeRATOR中，必須去除唾液酸才能產(chǎn)生酶活性，這意味著有關(guān)唾液酸化的信息丟失?？偠灾?，ImpaRATOR 和 OpeRATOR 酶共同提供了有關(guān)聚糖組成和 O-聚糖位點(diǎn)的完整信息。

Genovis的SialEXO產(chǎn)品是用于去除和分析唾液酸的唾液酸酶。這些酶對(duì)天然糖蛋白或游離的聚糖結(jié)構(gòu)上存在的 N- 和 O-連接聚糖均具有活性。SialEXO用于在用OpeRATOR或OglyZOR消化之前預(yù)處理O-糖基化蛋白。其他應(yīng)用包括降低樣品復(fù)雜性、電荷異構(gòu)體分析和外切糖苷酶陣列。N-連接、O-連接和游離聚糖的高效去唾液酸化快速去除唾液酸，增強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)電荷變體的分析可固定在即用型離心柱中。然后可以用FabRICATOR消化所得的去糖基化蛋白，并通過(guò)中級(jí)質(zhì)譜分析。我們將該工作流程應(yīng)用于依那西普的分析，雖然未經(jīng)處理的TNFR結(jié)構(gòu)域過(guò)于復(fù)雜而無(wú)法分析，但O-聚糖組成可以在用PNGase F處理后進(jìn)行分離和比較。ImpaRATOR 酶不會(huì)消化未修飾的絲氨酸或蘇氨酸殘基，也不會(huì)在糖蛋白的N-糖基化位點(diǎn)。

FucosEXO中的酶在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為87 kDa和64 kDa。FucosEXO在天然條件下水解糖蛋白上的巖藻糖，在6至8的pH值范圍內(nèi)顯示出高活性，無(wú)需輔助因子或添加劑。1. 用于方法開(kāi)發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4.即用型 - 只需加水即可。Genovis的FucosEXO 是 α-巖藻糖苷酶的混合物，用于在 N-和 O-糖基化蛋白或游離寡糖上有效水解 α1-2、α1-3 和 α1-4-連接的巖藻糖。人血清中 O-糖蛋白的富集：GlycOCATCH還可用于從復(fù)雜的樣品混合物（如人血清）中選擇性富集O-糖基化蛋白。簡(jiǎn)而言之，用Genovis的SialEXO處理血清并應(yīng)用于GlycOCATCH樹(shù)脂。洗滌樹(shù)脂，用8M尿素洗脫O-糖基化蛋白。用胰蛋白酶消化樣品并使用 RP-LC-MS/MS 進(jìn)行分析，并使用 Swiss Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)列表。O-糖基化蛋白以黃色表示。Genovis測(cè)試了 SialEXO 凍干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制劑上的性能。河南PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

GlycOCATCH?用于結(jié)合的 O-糖蛋白的可選洗脫方法：靶向 O-糖蛋白富集；甘肅高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究

Genovis的SialEXO固定化用于復(fù)雜糖蛋白的去唾液酸化：在設(shè)置反應(yīng)條件時(shí)，需要在所需的反應(yīng)時(shí)間和完成反應(yīng)所需的酶量之間進(jìn)行權(quán)衡。較高的酶量可保證在更短的時(shí)間內(nèi)完成周轉(zhuǎn)，但會(huì)使下游分析復(fù)雜化。為了避免此類問(wèn)題，我們以離心柱形式固定了活性SialEXO。這允許以更短的孵育時(shí)間孵育具有明顯更高量的唾液酸酶的糖蛋白底物。Genovis測(cè)試了 SialEXO 凍干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制劑上的性能。這種糖蛋白是一種具有挑戰(zhàn)性的底物，具有 6 個(gè) N- 和多達(dá) 26 個(gè) O-聚糖，由 α2,3 和 α2,6 連接的唾液酸修飾。對(duì)游離的N-聚糖的分析表明，SialEXO在溶液中完全脫唾液酸化，SialEXO固定化。甘肅高活性/無(wú)非特異酶活PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究