湖北PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

Core 1型O-聚糖的水解：O-糖基化不僅難以研究，其自然異質(zhì)性也會導(dǎo)致其他分析出現(xiàn)問題。例如，由于樣品中存在許多不同的糖型，因此對完整或中等水平的重糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析可能非常困難。酶法去除N-聚糖的解決方案已經(jīng)存在多年，Genvois的PNGase F是一種非常成熟的工具。O-糖的去除可能更具挑戰(zhàn)性，現(xiàn)有的O-糖釋放化學(xué)方法通常會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生重大修飾，因此不太適合下游分析。1. 用于方法開發(fā)的靈活產(chǎn)品形式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。唾液酸的去除有助于研究蛋白質(zhì)中的潛在變體。SialEXO酶可在電荷異構(gòu)體分析之前去除所有唾液酸。湖北PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

α連接的Genovis的GalNAcs的水解：GalNAcEXO 是一種 α-N-乙酰半乳糖胺苷酶，可有效水解糖蛋白上的末端 GalNAc 殘基。與絲氨酸或蘇氨酸連接的 GalNAc（稱為 Tn 抗原）被 GalNAcEXO 快速有效地水解，并且該酶還在 α1-3 連接的末端 GalNAcs 上顯示出活性。Genovis的GalNAcEXO 是一種外α-N-乙酰半乳糖胺酶，用于有效水解與糖蛋白（Tn 抗原）中的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連的 α-N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc）。該酶還在 α1-3 連接的末端 GalNAc 上顯示活性。GalNAcEXO 在天然條件下水解糖蛋白上的 GalNAc，在 pH 值 6.0 至 7.6 范圍內(nèi)具有高度活性。湖北PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究依那西普和曲妥珠單抗游離聚糖。

從依那西普水解β1-3和β1-4半乳糖：Genovis的GalactEXO Immobilized 對 β1-3 和 β1-4 連接的半乳糖均具有酶活性，這些半乳糖存在于裝飾有 N- 和 O-連接糖基化的生物制藥中，例如 Fc-融合蛋白依那西普。將依那西普與GalactEXO固定化孵育60分鐘，并在FabRICATOR消化后使用LC-MS在亞基水平上研究酶活性。TNFR和Fc/2片段分別分析。與GalactEXO Immobilized孵育導(dǎo)致N-連接和O-連接聚糖上的半乳糖殘基水解，這在半乳糖基化物種中被視為信號丟失。對游離的N-聚糖分析證實了LC-MS數(shù)據(jù)。

用于水解β1-3,4-連接半乳糖的固定化酶在離心柱中的糖蛋白上。Genovis的GalactEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價偶聯(lián)的GalactEXO酶，用于糖蛋白上β1-3,4-連接半乳糖的水解，而不會用酶污染z終制劑。Microspin 色譜柱可用于水解 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白。1. 易于使用的離心柱；2. 提高酶與底物的比例，提高消化效率；3. z終樣品中不含酶。GalactEXO 酶來源于 Akkermansia muciniphila 并重組表達(dá)，可有效水解 β1-3 和 β1-4 連接的半乳糖。GalactEXO微離心柱經(jīng)過格式化，可在30-60分鐘內(nèi)水解0.5mg糖蛋白中的半乳糖。OpeRATOR用于質(zhì)譜法進(jìn)行O-糖分析、O-糖肽圖譜以及中級分析，消化發(fā)生在O-糖基化位點的N端。

ImpaRATOR 是一種 O-聚糖依賴性蛋白酶，可催化糖蛋白和糖肽中與糖基化絲氨酸或蘇氨酸殘基相鄰的肽鍵的水解。它切割用粘蛋白型O-聚糖修飾的絲氨酸或蘇氨酸殘基的N-末端，包括唾液酸化物種。粘蛋白型O-聚糖是ImpaRAT活性所必需的，該酶不會消化未修飾的絲氨酸或蘇氨酸殘基，也不會在糖蛋白的N-糖基化位點。該酶接受 O-聚糖結(jié)構(gòu)，包括唾液酸化he心 1 和he心 2 結(jié)構(gòu)以及 Tn 抗原。Genovis的ImpaRATOR 來源于銅綠假單胞菌，在大腸桿菌中表達(dá)。該酶含有 His 標(biāo)簽，分子量為 97 kDa。ImpaRATOR 是一種 O-糖依賴性蛋白酶，可消化攜帶粘蛋白型O-聚糖的蛋白。海南N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

倍篤生物產(chǎn)品線涵蓋藥物研發(fā)的全流程，抗體結(jié)構(gòu)域分析蛋白酶、蛋白聚糖分析水解酶等。湖北PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

Genovis的PNGase F 是一種糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺與所有哺乳動物天冬酰胺連接復(fù)合物、雜交體或高甘露糖寡糖的內(nèi)層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。 在反應(yīng)過程中，從中去除聚糖的天冬酰胺殘基被脫酰胺為天冬氨酸。釋放的低聚糖完好無損，可用于進(jìn)一步分析。N-糖的去除被用于MS分析的樣品制備，以降低蛋白質(zhì)的異質(zhì)性，使游離的糖分析成為可能，并研究N-糖的功能作用。 該酶在大腸桿菌中表達(dá)，該重組基因來源于伊麗莎白金氏腦膜敗血癥。 評價抗體片段對完整蛋白聚集的影響。 IgG1 mAb1和mAb2在Biogen生產(chǎn)。 mAb1被糖基化，主要的糖型是具有0和1半乳糖的he心聚焦雙觸角聚糖(FA2和FA2G1); mAb2被糖基化。湖北PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究