熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    具體實(shí)驗(yàn)流程：注：該操作流程通常用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的活性，不適用于對(duì)細(xì)菌熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)。1．實(shí)驗(yàn)***天，消化并接種細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇合適的細(xì)胞）于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。2．等細(xì)胞密度達(dá)到70％時(shí)用Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒、LacZ的表達(dá)質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3．轉(zhuǎn)染24－36h后，吸取培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（無(wú)鈣和鎂離子）洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會(huì)被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4．在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入350μl預(yù)冷的harvestbuffer,于4℃或冰上放置10min裂解細(xì)胞。5．在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的ml微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：，每管100μl。6．依次取等體積的細(xì)胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會(huì)迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后5s內(nèi)必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。做D-熒光素鉀鹽測(cè)試找哪家公司？熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    或分裝于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。2）用預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基將儲(chǔ)存液稀釋至mg/mL的工作液濃度。3）去除細(xì)胞培養(yǎng)基。4）待圖像分析前，向細(xì)胞內(nèi)添加熒光素工作液，37℃孵育5-10min，然后進(jìn)行圖像分析。2.***成像分析1）用無(wú)菌的DPBS(w/oMg2+、Ca2+)配制15mg/mL的熒光素的儲(chǔ)存液，混勻。2）用μm濾膜過(guò)濾除菌。立即使用，或分裝于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。3）腹腔注射（.），按照150mg/kg的熒光素/體重濃度進(jìn)行注射。4）注射入體內(nèi)10-15min（待光信號(hào)達(dá)到更強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期）后進(jìn)行成像分析。注：建議對(duì)每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，從而確定更高信號(hào)檢測(cè)時(shí)間和信號(hào)平臺(tái)期。注意事項(xiàng)1）本品（fireflyluciferin）和甲蟲熒光素（beetleluciferin）只只是不同公司在命名上的差異,都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylicacid。2）注射方式、動(dòng)物類型以及體重等都會(huì)影響信號(hào)的發(fā)射，因此建議每次實(shí)驗(yàn)都要做熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線，確定更佳信號(hào)平臺(tái)期和更佳的檢測(cè)時(shí)間。3）如果要進(jìn)行ATP的檢測(cè)，盡量避免外源ATP的污染，如操作時(shí)戴手套并使用ATP-free的實(shí)驗(yàn)耗材，在進(jìn)行熒光素的溶解時(shí)應(yīng)使用ATP-free無(wú)菌水。蘇州螢火蟲熒光素酶D-熒光素鉀鹽哪家好D-熒光素有時(shí)候也叫游離酸。

    可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式進(jìn)行半衰期為一小時(shí)的“輝光型”信號(hào)在大量檢測(cè)板之間提供一致的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基兼容海腎熒光素酶海腎螢光素酶是一種從海桑（Renillareniformis）分離的36kDa蛋白。與螢火蟲熒光素酶相比，海腎熒光素酶的底物和輔因子要求不同。海腎熒光素酶在氧氣存在下使用腔腸素，產(chǎn)生480nm的藍(lán)光。與螢火蟲螢光素酶類似，海腎螢光素酶因其底物要求和光輸出方面的差異而可用于雙重報(bào)告檢測(cè)。Amplite?海腎熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定Amplite?Renilla螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（#AAT-12535）提供了一種快速，靈敏的方法，可以使用專有的發(fā)光配方在基于細(xì)胞的檢測(cè)中檢海腎螢光素酶的活性，與海腎螢光素酶相互作用后，該試劑產(chǎn)生具有強(qiáng)光的產(chǎn)物。Amplite?海腎熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒特點(diǎn)：該測(cè)定法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基兼容該試劑盒可以測(cè)量野生型和合成hRluc基因的原始表達(dá)或基因表達(dá)每個(gè)試劑盒均包含可以方便96孔和384孔板檢測(cè)所必不可少的組分各類螢光素酶底物，輔因子和物理特性：近幾十年來(lái)，腺苷三磷酸(ATP)生物發(fā)光技術(shù)得到了很大的發(fā)展，已經(jīng)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和生物量計(jì)數(shù)等方面廣泛應(yīng)用。

    而發(fā)出不同顏色的熒光。螢火蟲有2000多種，而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關(guān)昆蟲）則有更多，因此它們的熒光素酶對(duì)于分子系統(tǒng)學(xué)研究很有用。目前研究得更透徹的熒光素酶是來(lái)自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinuspyralis）。熒光素酶報(bào)告基因（Luc）是指以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發(fā)光的一類酶，哺乳細(xì)胞無(wú)內(nèi)源性熒光素酶。更常用的熒光素酶有細(xì)菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶。細(xì)菌熒光素酶對(duì)熱敏感，因此在哺乳細(xì)胞的應(yīng)用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測(cè)線性范圍寬達(dá)7～8個(gè)數(shù)量級(jí)，是更常用于哺乳細(xì)胞的報(bào)道基因，用熒光比色計(jì)即可檢測(cè)酶活性，因而適用于高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應(yīng)用，無(wú)需裂解細(xì)胞即可檢測(cè)酶活性。Renilla熒光素酶催化腸腔（coelenterazine）氧化，產(chǎn)物可透過(guò)生物膜，可能是更適用于活細(xì)胞的報(bào)告分子。將熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。D-熒光素鉀鹽測(cè)試方法是體外生物發(fā)光檢測(cè)。

    可用于需要低檢測(cè)限的測(cè)定具有用于研究基因調(diào)控和功能的快速，簡(jiǎn)單且均一的生物發(fā)光測(cè)定法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基的使用兼容高斯熒光素酶近年來(lái)，其他熒光素酶（例如高斯熒光素酶）的使用有所增加，因?yàn)檫@些報(bào)告基因較小，并且不需要ATP的存在。高斯熒光素酶是一種20kD的蛋白質(zhì)，可通過(guò)氧氣催化腔腸素氧化，產(chǎn)生光。來(lái)自于海洋足類高斯氏菌的生物發(fā)光酶在表達(dá)后可有效地從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分泌出來(lái)。Amplite?高斯熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒使用專有的發(fā)光配方來(lái)定量細(xì)胞培養(yǎng)基中的熒光素酶活性。當(dāng)該試劑與高斯熒光素酶相互作用時(shí)，產(chǎn)***光產(chǎn)物，該發(fā)光產(chǎn)物提供強(qiáng)發(fā)光。Amplite高斯熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試劑盒特點(diǎn)：提供了與HTS液體處理儀器兼容的所有基本組件它們具有高靈敏度，可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式進(jìn)行半衰期為一小時(shí)的“輝光型”信號(hào)在大量檢測(cè)板之間提供一致的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基兼容海腎熒光素酶海腎螢光素酶是一種從海桑（Renillareniformis）分離的36kDa蛋白。與螢火蟲熒光素酶相比，海腎熒光素酶的底物和輔因子要求不同。海腎熒光素酶在氧氣存在下使用腔腸素，產(chǎn)生480nm的藍(lán)光。與螢火蟲螢光素酶類似。南京D-熒光素鉀鹽測(cè)試公司有哪幾家。蘇州螢火蟲熒光素酶D-熒光素鉀鹽哪家好

D-熒光素鹽也算是鈉鹽和鉀鹽。熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    8．取剩余裂解液測(cè)定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。9.用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見(jiàn)光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。注意事項(xiàng)：1．熒光素酶檢測(cè)試劑需在15-25℃條件下預(yù)平衡后再進(jìn)行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)檢測(cè)。當(dāng)用液閃計(jì)數(shù)儀時(shí)，加入熒光素酶檢測(cè)試劑后立即輕輕混勻。2．如果細(xì)胞裂解后不能立即對(duì)提取物進(jìn)行檢測(cè)，樣品可以在冰上保存大約5h，在-70℃可保存數(shù)月。不要反復(fù)凍融以避免酶活性的降低。3．利用上述方法檢測(cè)冷的樣品時(shí)，其信號(hào)強(qiáng)度將下降5-15%。4．在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號(hào)超出線性范圍（信號(hào)溢出）可用裂解液將樣品進(jìn)行稀釋。5．不要儲(chǔ)存稀釋過(guò)的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。6．一些熒光儀在進(jìn)行檢測(cè)前需要1-2s的穩(wěn)定，因此建議在開(kāi)機(jī)后過(guò)一段時(shí)間再進(jìn)行檢測(cè)操作。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)主要有哪些用途？a.啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析，將啟動(dòng)子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報(bào)告載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。b.啟動(dòng)子SNP分析，一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性。熒光素酶D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

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