天津免疫沉淀檢測CoIP-mass spectrometry

免疫共沉淀CoIP實驗，細(xì)胞的收集及裂解方法如下：

收集2E7個細(xì)胞樣品，加入PBS洗滌細(xì)胞，離心后棄上清收集細(xì)胞沉淀。

準(zhǔn)備500μl預(yù)冷的CellLysisBuffer,分別加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF，混勻后加進(jìn)細(xì)胞沉淀中吹打均勻，冰上孵育30min，期間渦旋混勻幾次。

4℃,12000rpm離心10min，取上清，進(jìn)行蛋白濃度測定及后續(xù)實驗。廣州基云生物，在IP互作組檢測和關(guān)鍵機(jī)制分子篩選驗證領(lǐng)域，具有豐富的經(jīng)驗，助力您的互作機(jī)制研究，歡迎垂詢合作。 Co-IP技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域，助力科研人員探索生命奧秘！天津免疫沉淀檢測CoIP-mass spectrometry

結(jié)合了抗體的磁珠或樹脂（Beads）與樣本裂解液孵育，通過”抗原-抗體“之間的免疫作用，誘餌蛋白被吸附在Beads上，與此同時，誘餌蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌去掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫緩沖液將互作蛋白復(fù)合物從Beads上洗脫下來，得到免疫共沉淀（Co-IP）產(chǎn)物。Co-IP產(chǎn)物既可以用WesternBlot檢測已知蛋白，也可以用質(zhì)譜鑒定未知蛋白。當(dāng)沒有合適的誘餌蛋白抗體時，還可以通過表達(dá)融合了Flag標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用Flag標(biāo)簽抗體做免疫沉淀。即樣本過表達(dá)Flag-Bait，經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再經(jīng)洗滌、洗脫后，用WB或質(zhì)譜檢測。中國香港互作機(jī)制CoIP mass spectrometry檢測免疫共沉淀法證實蛋白互作，基于抗體專一性，揭示生理性相互作用。

對于Co-IP實驗初學(xué)者，常遇到的“坑”主要有：首先，抗體選擇至關(guān)重要。選擇特異性不強(qiáng)或親和力低的抗體，可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合，干擾實驗結(jié)果。因此，選擇經(jīng)過驗證的高質(zhì)量抗體是關(guān)鍵。其次，實驗操作規(guī)范不容忽視。細(xì)胞裂解不充分、洗滌不當(dāng)?shù)榷紩绊懙鞍讖?fù)合物的純化，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。初學(xué)者應(yīng)嚴(yán)格按照步驟操作，確保每一步都精確無誤。再者，結(jié)果解讀需謹(jǐn)慎。初學(xué)者可能因經(jīng)驗不足，誤將非特異性結(jié)合視為真實相互作用。因此，解讀結(jié)果時，需結(jié)合其他實驗方法如Western Blot進(jìn)行驗證。另外，實驗安全不可忽視。遵守實驗室規(guī)章制度，注意個人防護(hù)和實驗室衛(wèi)生，是確保實驗順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。綜上所述，初學(xué)者在進(jìn)行Co-IP實驗時，應(yīng)關(guān)注抗體選擇、實驗操作、結(jié)果解讀和實驗安全等方面，通過不斷學(xué)習(xí)和實踐，逐漸積累經(jīng)驗，避免常見錯誤。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是一種基于抗原與抗體特異性結(jié)合用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的方法。常用于候選目標(biāo)蛋白質(zhì)之間是否有相互作用，也用于確定與已知蛋白質(zhì)互作的其它未知蛋白質(zhì)相互作用。基本原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。用蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A，那么與A互作的蛋白質(zhì)也能沉淀下來，此時獲得與A互作的蛋白復(fù)合物。若已知AB互作，則用蛋白復(fù)合物進(jìn)行WB實驗檢測B；若鑒定蛋白復(fù)合物中有哪些蛋白，則對復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測。免疫共沉淀實驗流程：蛋白質(zhì)樣本收集-A抗體沉淀目的蛋白A-SDS-PAGE分離-WB檢測B蛋白或者質(zhì)譜鑒定互作蛋白。免疫共沉淀法可信度高，可發(fā)現(xiàn)新蛋白搭檔，但存局限，需結(jié)合其他方法驗證。

Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的重要方法。它利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，并通過沉淀步驟將復(fù)合物從細(xì)胞或組織提取物中分離出來。這種技術(shù)能夠直接檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用，為揭示蛋白質(zhì)功能和調(diào)控機(jī)制提供了有力工具。在實際應(yīng)用中，研究人員需要選擇合適的抗體，確保其與目標(biāo)蛋白具有特異性結(jié)合能力。此外，樣品的制備、洗滌和離心等步驟也至關(guān)重要，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。Co-IP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病機(jī)制等。然而，該技術(shù)也存在一些潛在的限制和影響因素，如非特異性結(jié)合和背景噪聲等，因此在使用時需要注意相應(yīng)的實驗條件和操作細(xì)節(jié)?？傊珻o-IP技術(shù)是一種重要的蛋白質(zhì)相互作用研究工具，其結(jié)果可靠且有助于深入了解蛋白質(zhì)功能和調(diào)控機(jī)制。CoIP實驗技術(shù)重復(fù)和生物重復(fù)設(shè)計建議。重慶免疫共沉淀檢測CoIP聯(lián)合質(zhì)譜檢測

IP-WB實驗常用于驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用。天津免疫沉淀檢測CoIP-mass spectrometry

IP-Mass（免疫沉淀-質(zhì)譜）實驗流程主要包括以下步驟：樣品制備：收集細(xì)胞或組織樣品，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)牧呀馓幚恚葬尫偶?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。免疫沉淀：將特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后，將復(fù)合物與固相載體（如磁珠）結(jié)合，通過洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。洗脫：從固相載體上洗脫免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物，以便進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析。蛋白酶消化：將洗脫下來的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行蛋白酶消化，將其分解成小分子的肽段。質(zhì)譜分析：將消化后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過測量肽段的質(zhì)量和電荷信息，鑒定出蛋白質(zhì)的種類和序列。數(shù)據(jù)分析：對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，確定與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，以及相互作用的可能性和強(qiáng)度。IP-Mass實驗流程結(jié)合了免疫沉淀的高特異性與質(zhì)譜分析的高靈敏度，能夠準(zhǔn)確地鑒定蛋白質(zhì)相互作用，并為后續(xù)的功能研究和藥物開發(fā)提供有力支持。天津免疫沉淀檢測CoIP-mass spectrometry