南通組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴增帶：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成。南通組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。南通微量熒光定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)可以用于分析病癥、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達(dá)水平的變化。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）、引物（終濃度）、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+（終濃度）、補加雙蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實驗調(diào)整，以上表格只提供大致參考值。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。引物有多種設(shè)計方法，由PCR在實驗中的目的決定，但基本原則相同。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。南通實時數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。南通組織PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DN段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達(dá)到納克、微克、毫克級的特異性DN段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常，例如梅毒。一期梅毒。即硬下疳 ，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 、淺潰瘍 ，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結(jié)腫大。二期梅毒。在一期梅毒 1-2 個月之后，全身皮膚、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹、斑疹、、疹等。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣，傳染性強。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年，皮膚為樹膠樣腫，還可涉及骨、關(guān)節(jié)、心、血管，表現(xiàn)為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等。　需要檢查的人群：疑似某種特定的疾病病人，進行分子特異性檢查。南通組織PCR檢測技術(shù)

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