廈門分子生物學數(shù)字PCR研究方案

聚合酶鏈式反應PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。廈門分子生物學數(shù)字PCR研究方案

聚合酶鏈式反應的試驗污染：實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。廈門分子生物學數(shù)字PCR研究方案聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。

聚合酶鏈式反應準備：PCR引物設計：PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

聚合酶鏈式反應：1976年，中國科學家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發(fā)展也做出了基礎性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調溫度至DNA聚合酶很適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。嵌套聚合酶鏈反應的兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR。

聚合酶鏈式反應的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。重疊延伸聚合酶鏈反應可以將缺失、插入或點突變引入DNA序列。廣州骨頭Real-time PCR研究方案

熱啟動聚合酶鏈式反應可以通過將反應組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前。廈門分子生物學數(shù)字PCR研究方案

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。廈門分子生物學數(shù)字PCR研究方案

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